Summary
이 프로토콜은 세포를 고정화시키는 알긴산의 신속한 물리적 겔화에 의한 세포 캡슐화 방법을 예시한다. 얻어진 마이크로비드는 시간이 지남에 따라 아밀로이드-β의 제어되고 지속적인 분비를 허용하고 시험관 내 및 생체 내 모델에서 분비 된 아밀로이드-β의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
아밀로이드 캐스케이드 가설에 따르면, 알츠하이머 병 (AD)의 발달에서 가장 오래된 트리거는 독성 아밀로이드 β (Aβ) 단편의 축적이며, 결국 질병의 고전적인 특징으로 이어진다 : 아밀로이드 플라크, 신경 섬유 엉킴과 시냅스 및 신경 손실. 질병 진행을 반영하는 관련 비 형질전환 전임상 모델의 부족은 효과적인 약물 치료의 발견을 방해하는 주요 요인 중 하나입니다. 이를 위해, 우리는 만성 Aβ 생산의 효과에 대한 연구에 유용한 아밀로이드 분비 세포를 함유하는 알긴산 마이크로비드의 제조를 위한 프로토콜을 개발하였다.
이전에 인간 APP 유전자로 형질감염된 중국 햄스터 난소 세포를, Aβ(즉, 7PA2 세포)를 분비하는 것이 이 연구에서 사용되었다. Aβ의 서방성을 위한 3차원(3D) 체외 모델은 알긴산에서 7PA2 세포를 캡슐화하여 제조하였다. 이 공정은 생체 내 추가 연구를 위해 500-600 μm의 비드 직경을 대상으로 최적화되었습니다. 알긴산에서 7PA2 세포 캡슐화의 최적화는 제조 파라미터, 예를 들어, 알긴산 농도, 겔 유량, 정전기 전위, 헤드 진동 주파수, 겔화 용액을 변경하여 수행하였다. 분비된 Aβ의 수준은 시간이 지남에 따라 분석되었고 알긴산 비드와 표준 세포 배양 방법(최대 96시간)을 비교하였다.
1.5 x 106 7PA2 세포/mL의 농도와 HEPES로 완충된 2%(w/v)의 알긴산 농도및 0.5 M 염화칼슘의 후속 겔화5분 동안 가장 안정적인 미생물을 제조하는 것으로 나타났다. 제조된 마이크로비드는 1) 균일한 크기, 2) 평균 직경 550 μm, 3) 마이크로비드당 약 100-150개의 세포를 함유하고 4) Aβ를 분비할 수 있었다.
결론적으로, 아밀로이드 생성 7PA2 세포를 포함하는 안정된 알긴산 마이크로비드의 생산을 위한 우리의 최적화된 방법은 시험관내 및 생체내에서 AD의 중요한 양상을 모델링할 수 있게 할 수 있다.
Introduction
신경 퇴행성 질환을 모델링하는 것은 뇌의 복잡하고 복잡한 특성으로 인해 어렵습니다. 알츠하이머 병에서 (AD), 시 냅 스 기능 및 뉴런의 죽음의 진보적인 손실 아 밀 로이드 베타의 지속적인된 과잉 생산 및 축적의 다운 스트림 효과 것으로 추정 된다 (Aβ) 아 밀 로이드 전구체의 비정상적인 처리 다음 펩 티 드 단백질 (APP) 아밀로이드 캐스케이드 가설에따라 1.
이 아밀로이드 유도 병리학의 기계장치를 이해하고 새로운 처리 표적의 확인을 돕기 위하여, 과학자는 생체 내 전임상 모형에서 다양한 개발했습니다. 모델의 한 범주는 쥐 뇌에 합성 Aβ 펩티드의 볼루스 주입을 활용2,3,4. 이러한 모델의 주요 한계는 한 번에 모두 증착 된 고농도의 Aβ 펩티드를 사용하여 단일 포인트 또는 반복 치료에 의존한다는 것입니다. 이것은 질병 5에서 Aβ의 방출의 만성, 지속적인특성과 일치하지 않습니다. 생체 내 모델의 또 다른 범주는질병6,7,8,9의가족 변이와 연결된 하나 이상의 유전 적 돌연변이를 발현하는 형질전환 동물모델입니다. 10. 그러나 가족 AD가 모든 알츠하이머 병의 5 % 미만을 차지하기 때문에11,인간에서 산발적 인 AD로 번역하는 이러한 모델의 관련성은 12. 형질전환 접근법의 또 다른 단점은 출생에서 가속된 Aβ 형성이며, 이는 환자 12의 산발적인 AD에서 질병 진행을 유사하게 너무 빠르고 공격적으로 인지 기능 및 병리학 적 변화의 적자로 변환합니다. . 예를 들어, 5x FAD 모델은 1.5개월13개월만에 플라크를 생성합니다.
흥미롭게도, 이 두 범주는 AD 연구 2,3,4,5,6,및 때때로 그들은 동반되는 관련성의 인지 기능의 변화를 초래합니다. 아밀로이드 플라크6,8,타우 인산화6,7 및 / 또는 시냅스 및 신경 손실7,9, 14. 그러나 이러한 유형의 모델은 AD의 나중 단계와 종종 연관되는 뇌의 높은 수준의 아밀로이드 의 영향에 대한 통찰력을 줄 수 있지만, Aβ에 대한 만성 적이고 지속적인 노출에 대한 응답으로 나타나는 이전 변화를 반영하지 못합니다. 펩티드(12)및 세포외 기질(16)에서 시냅스마커(15) 및 성분의 발현이 변경된 것과 같은 것이다. 따라서, 생체 내 인지에 대한 지속적인 Aβ 분비의 효과를 보다 정확하게 설명하고 병리학의 변화를 설명하는 만성 모델을 만들기 위한 필요성이 여전히 남아 있다.
이를 위해, 우리는 하이드로겔 마이크로비드 내의 아밀로이드 분비 세포를 고정시킴으로써 통제된 방식으로 Aβ의 일정하고 지속적인 분비를 허용하는 시스템을 개발했으며, 이는 성인 쥐 뇌 내에 이식되어 모델을 모델링할 수 있습니다. 산발적 인 광고의.
알긴산은 생체적합성으로 선택된 생체재료였으며 생체내이식시 어떠한 불리한 반응도 유도하지 않는다(17). 알긴산 하이드로겔의 세포 캡슐화는 지난 4년 동안 잘 확립되었습니다. 클리닉으로의 번역의 첫 번째 예는 제 1 형 당뇨병 의 치료를 위해보고되었다17. 랑게르한스 섬의 성공적인 캡슐화에 대한 최초의 보고서는 1980년으로 거슬러 올라갑니다. 인슐린 분비 세포를 함유하는 마이크로비드의 이식은 췌장 기능을 회복함에 따라 당뇨병 환자를 위한 치료 옵션을 혁신시켰으며, 인슐린 주사요법(18)의필요성을 제거하였다. 이 작품은 세포 캡슐화가 기계적 또는 화학적 인지 외부 응력으로부터 그들을 보호 할 수있는 방법에 대한 보고서. 사실, 알긴산 비드는 세포 부산물의 영양분 및 정리를 위해 주변 매체에 충분한 접근을 허용하는 동안, 그들의 표현형을 보존하는 주변 환경으로부터 장벽 및 분리 세포역할을 한다19. 또한, 알긴산의 사용은 연조직(20)의기계적 특성의 일치를 허용한다. 알긴산 하이드로겔은 알긴산 농도 및 가교 밀도20,21을단순히 변화시킴으로써 1-30 kPa의 강성을 갖도록 튜닝될 수 있다. 이는 생체외에서 캡슐화된 세포의 표현형 발현을 유지하는 것뿐만 아니라 생체내 생착 후 임의의 염증 효과를 피하기위한 필수적인 양상이다(22).
본 프로토콜에서, 7PA2 세포-인간 APP V717F 돌연변이 유전자(23)로 안정적으로 형질이 나는 중국 햄스터 난소 세포주-사용된다. 이들 세포는 지속적으로 Aβ1-4224,25를포함하는 APP의 촉매 산물을 생산하고, 전임상, 급성 생체내 연구 26에서 합성 생산의 대안으로 Aβ를 생성하는데 사용되어 왔다. 우리는 생체 분자의 지속적인 분비를 허용하도록 설계된 '부드러운'알긴산 마이크로 비드 내에서 7PA2 세포를 고정시키는 제조 방법을 설명합니다. 개념의 증명으로서, 우리는 시간이 지남에 따라 Aβ1-42 펩티드의 방출에 대해 보고한다. 사용되는 알긴산은 분자량이 120,000-190,000 g/mol인 저점도 알긴산이며, 1.56(M/G)의 guluronic 비율을 가진 만루노닉입니다.
추가 연구에서, 이들 마이크로비드는 생체내 및 병리학적 생체내 행동에 대한 만성 Aβ 분비의 효과를 연구하기 위해 AD(예를 들어, 해마)와 관련성이 있는 쥐 뇌의 영역 내에서 안전하게 이식될 수 있다. 또한, 이 시스템은 생체외 및 생체외 응용 분야에서 만성 Aβ 방출의 효과를 연구하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 7PA2 함유 알긴산 마이크로비드는 AD와 관련된 세포 메커니즘에 대한 만성 Aβ 노출의 효과를 평가하기 위해 신경 세포 또는 성상 세포 배양과 함께 시험관 내에서 배양될 수 있다. 더욱이, 이 방법은 생체 내 전기생리학에서 만성 Aβ 생산과 장기 간의 위약술 사이의 관계를 조사하는데 사용될 수 있다.
이 프로토콜의 하이라이트는 제조 방법의 모듈성과 유연성이며, 이를 통해 제조 매개 변수를 미세 조정하여 목표 치수로 알긴산 비드를 제조할 수 있습니다. 응용 분야에 따라, 프로토콜은 마이크로비드 크기, 캡슐화된 세포의 밀도 및 마이크로비드 강성에 관한 맞춤형 표적을 얻기 위해 조정될 수 있다. 이 프로토콜은 다양한 세포 유형의 캡슐화에 사용될 수 있으며, 상이한 병리학을 연구하기 위해 보다 관련성이 있는 3차원(3D) 체외 모델을 개발할 수 있다. 우리는 최근에 알긴산 캡슐화 된 세포가 암 진행20의 초기단계를 모델링하는 데 어떻게 사용될 수 있는지에 대해 보고했다.
캡슐화 과정의 개념은 노즐을 통해 알긴산 용액에 부유 된 세포의 층류 제트의 압출에 기초한다. 진동헤드는 제어된 주파수로 제트를 방해하여 동등한 크기의 알긴산 기반 물방울을 생성합니다. 외부 전기장을 사용하면 형성된 알긴산 기반 방울을 분리할 수 있으며, 칼슘 이온과 같은 이완이 풍부한 용액과 접촉하면 구형 모양을 유지하면서 신속하게 상호 연결할 수 있습니다. 겔화 용액에서의 배양은 균질한 물리적 하이드로겔(27) 내에서 세포를함유하는 구형 마이크로비드의 형성을 허용한다. 마이크로비드 및 알긴산 하이드로겔의 목표 크기는 장기간(주) 동안 세포 배양 배지와 영양분및 산소 교환을 허용합니다. 그림 1 사용된 캡슐화 장치의 개략적 표현을 나타내기(도1B).
그림 1 : 캡슐화 시스템. (A) 캡슐화 시스템의 개략적 표현. 알긴산 세포 현탁액은 주사기(2)에 적재되고 주사기 펌프(1)에서 설정된 압출 속도로 저장소를 통해 공급된다. 저수지에서 진동 모자(3)는 파형 발생기(4)에 의해 설정된 주파수에서 진동하여 동일한 간격으로 스트림을 방해하여 동일한 크기의 물방울을 형성합니다. 용액이 노즐(5)과 액적을 통해 공급됨에 따라 정전기 전위가 전압 발생기(6)에 의해 설정된 전극(7)에 걸쳐 가해지며, 이는 물방울의 표면을 약간 충전하여 반발의 결과로 스트림이 확산될 수 있도록 합니다. 정전기력. 물방울이 겔화 목욕 (8)과 결합함에 따라, Ca2+구동 -구동 알긴산의 가교는 구형 마이크로 비드의 형성을 초래한다. (B) 알긴산 마이크로비드를 제조하기 전에 캡슐화기의 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
미생물 크기는 용도에 따라 변경될 수 있습니다. 마이크로비드의 크기를 제어하기 위해, 도 1A 및 프로토콜에 설명된 다양한 파라미터들이 그에 따라 조정된다. 사용되는 노즐의 내부 직경은 액적의 크기에 상당한 영향을 미칩니다. 캡슐화 파라미터, 즉 압출 속도, 진동 주파수 및 전압을 추가로 조정하는 것이 일관된 크기 분포를 달성하는 데 핵심적인 핵심입니다. 테이블 (표) 1은 다른 매개 변수가이 시스템으로 달성 된 마이크로 비드의 크기를 변경할 수있는 방법을 설명합니다.
| 매개 변수 | 노즐 크기 | 진동 주파수 | 유량 | 전극 전압 |
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| 비드 사이즈 |
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표 1: 제조 매개 변수 및 미생물 크기에 미치는 영향. 이 표는 사용된 용액의 노즐 및 점도에 관계없이 각 파라미터가 제조된 마이크로비드의 결과 크기에 미치는 영향을 보여 줍니다.
Protocol
1. 준비
- 알긴산 스톡 솔루션의 ~4% (w/v) 100 mL를 준비합니다.
- 4.4 g의 알긴산 나트륨 소금을 측정하고 100 mL의 HEPES 완충 식염수 (HBS, 20 mM HEPES (0.477 g)에 150 mM NaCl (0.877 g)을 탈온 수분으로 첨가하십시오.
- 분당 ~500회 회전(rpm)에서 자기 교반기를 사용하고 최대 50°C까지 가열하여 완전한 알긴산 수분을 공급합니다.
참고: 알긴산은 완전히 수분을 공급하기 위해 1~2시간이 필요할 수 있습니다. 시간을 절약하기 위해, 알긴산 용액은 캡슐화 프로토콜보다 하루 전에 이루어질 수 있고 다음 날까지 4°C에서 보관할 수 있다. 알긴산이 냉장보관되면, 수조나 핫플레이트를 사용하여 37°C로 부드럽게 가열하고 사용 직전에 마그네틱 교반기로 교반합니다. - 사용 전에 0.22 μm 기공 폴리에에르설포온(PES) 필터를 사용하여 알긴산 용액을 멸균 필터. 알긴산의 쉬운 흐름을 허용하기 위해 37 °C에서 여과하는 것이 좋습니다. 온도가 떨어질 수 있다면 점도가 증가합니다.
- 0.5 M CaCl2의1,000 mL을 준비하십시오.
- 무수 CaCl2의 55.49 g의 무게와 HBS의 1,000 mL (20 mM HEPES 및 1,000 mM NaCl에서 1,000 mL의 탈이온수)에 용해하십시오.
- 0.22 μm 기공 PES 필터를 사용한 멸균 필터.
- 용해 믹스 100 mL을 준비합니다.
- 인산완식염에 100 mM HEPES (23.83 g) 및 500 mM 구화나트륨 디하이드레이트 (147.05 g) 용액을 준비합니다.
- NaOH 또는 HCl을 사용하여 pH 7.4로 조정합니다.
2. 캡슐화 시스템 설정
- 층류 후드를 청소합니다.
- UV 노출을 사용하여 캡슐화기 포함 라미나 흐름 후드를 살균한 다음 70% v/v 에탄올 용액으로 분무합니다.
- 캡슐화 기 시스템을 70% v/v 에탄올 용액 10 mL로 세척한 다음 멸균 탈이온수 10mL를 처리합니다.
- 300 μm 노즐을 부착하고 2.1.2 단계를 반복하십시오.
- 여과 된 알긴산 용액을 함유 한 병에 스프레이, 여과 된 염화 칼슘 용액과 70 % v / v 에탄올 용액과 함께 사용되는 모든 도구, 장비 및 빈 배양 판을 함유하고 층류 후드에 넣습니다. 사용하기 전에 자외선을 다시 켜서 30분 동안 완전히 살균하십시오.
- 생물학적 등급 소독제로 채워진 폐기물 비커를 준비하고 비커를 후드에 넣습니다.
- 비커에 멸균 CaCl 2(수성) 용액 100mL를 채우고 마그네틱 교반기에 넣습니다. 교반 속도를 100rpm으로 설정합니다. 비커를 노즐 끝에서 18cm 높이로 자기 플랫폼에 놓습니다. 이 비커는 알긴산 구슬을 수집하고 겔화를 허용하는 데 사용됩니다.
- 캡슐화를 위해 셀을 준비합니다.
- 인큐베이터에서 세포를 제거하고 0.25% 트립신-EDTA 용액을 사용하여 가까운 부유 플라스크에서 분리하고 5-10 분 동안 37 °C에서 배양합니다.
- 세포 밀도의 추정을 위해 샘플을 분리한 다음, 나머지 세포를 1,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수득하였다.
- HBS (20 mM HEPES 및 150 mM NaCl)에서 펠릿을 다시 일시 중단하여 최종 원하는 세포 농도를 두 배로 늘리십시오 (예 : 최종 농도 1.5 x 106 세포 / mL의 경우 3 x 106 세포 / mL의 농도를 달성하기 위해 HBS에서 세포를 다시 일시 중단하십시오).
- 50 mL 원심분리기 튜브에서, 세포 현탁액을 ~4% (w/v) 알긴산 용액과 1:1 비율로 혼합하여 원하는 세포 농도(예를 들어, 1.5 x 106 세포/mL)를 포함하는 최종 현탁액을 ~2% (w/v) 알긴산액으로 얻었다.
- 캡슐화 매개변수를 설정합니다.
- 캡슐화기 기계의 속도를 최대 압출 속도(8.9mL/min) 및 전압 1.0kV로 설정하고 주파수를 5,500Hz로 설정합니다.
참고: 이러한 파라미터는 이전에 직경 550 μm의 마이크로비드를 얻기 위해 최적화되었습니다.
- 캡슐화기 기계의 속도를 최대 압출 속도(8.9mL/min) 및 전압 1.0kV로 설정하고 주파수를 5,500Hz로 설정합니다.
3. 제작
- 마이크로비드를 제작합니다.
- 20 mL 주사기에서 세포 알긴산 현탁액의 5 mL를 적재하고 캡슐화기에 주사기를 부착하십시오.
- 피더를 통해 세포 알긴산 현탁액을 밀어 낼 흐름을 활성화하여 캡슐화기를 시작합니다. 노즐을 통해 물방울의 스트림이 돌출됩니다.
- 초기 비커에서 처음 1 mL을 수집하여 초기 비균일 스트림을 무효화합니다.
- 나머지 4 mL을 계속 실행하여 방울이 CaCl2 겔화 욕조에 빠질 수 있도록 합니다. 각 밀리리터는 별도로(그러나 연속적으로) 실행하고 필요한 경우 4개의 다른 겔화 욕조에서 수집될 수 있습니다.
참고 : 겔화 욕조와 접촉하면 물방울의 알긴산은 즉시 겔화 욕조의 칼슘 이온과 상호 연결되고 구형 마이크로 비드를 형성합니다. - 1 분 후, 자기 플랫폼에서 겔화 비커를 제거하고 마이크로 비드가 교반없이 추가로 4 분 동안 앉을 수 있게하십시오 (실온에서 마이크로 비드에 걸쳐 완전한 겔화를 허용하는 데 필요한 시간).
- 마이크로비드를 검색합니다.
- 한 쌍의 멸균 핀셋을 사용하여 큰 알긴산 파편 이나 유물을 제거 한 다음 멸균 플라스틱 파이펫을 사용하여 74 μm 메쉬 필터로 옮겨 겔화 욕조에서 마이크로 비드를 회수합니다.
- 적절한 배양 배지를 사용하여 마이크로비드를 원심분리관으로 옮기고 세포 배양 배지에서 5분 동안 평형을 허용한다.
- 인큐베이션 및 추가 실험을 위해 플라스크, 플레이트 또는 페트리 접시로 옮김을 옮니다.
참고: 젤화 목욕은 재사용해서는 안 됩니다.
4. 마이크로비드의 테스트 및 사용
- 미생물 품질을 테스트합니다.
- 캡슐화 및 배양 후 세포 생존율(또는 다른 생물학적 판독값)을 평가하기 위해, 용해 혼합을 사용하여 캡슐화된 세포를 방출하도록 마이크로비드를 부드럽게 중단시낸다.
참고: 용해 혼합의 필요한 부피는 테스트당 사용되는 마이크로비드의 수에 따라 달라집니다. 제안된 배급은 캡슐화된 세포의 매 1 mL에 용해 혼합물의 4 mL입니다. 이 단계는 각 미생물 집단을 이리저리 단일 샘플에서만 수행하면 됩니다. - 세포를 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 5% CO2로 10분 동안 배양하였다.
- trypan 파란색으로 세포를 염색하고 혈세포 측정챔버를 사용하여 평소와 같이 용액에서 세포 생존 가능성을 추정합니다.
참고: 셀 생존 가능성의 추정을 위해 자동화된 셀 카운터를 사용하는 경우, 계산을 방해하는 알긴산 유물을 피하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 이러한 경우에, naual 세포 계산은 조언됩니다. - 미생물 안정성을 평가하기 위해 현미경 및 이미징 소프트웨어를 사용하여 시간 과정에 걸쳐 각 미생물 집단의 샘플의 평균 직경을 측정합니다. 직경의 극적인 후속 변화는 알긴산 의 저하를 나타낼 수 있습니다.
- 캡슐화 및 배양 후 세포 생존율(또는 다른 생물학적 판독값)을 평가하기 위해, 용해 혼합을 사용하여 캡슐화된 세포를 방출하도록 마이크로비드를 부드럽게 중단시낸다.
- 분비 된 Aβ의 검출을 위해 마이크로 비드를 사용합니다.
- 7PA2 세포로부터의 시료 배양 배지는 24시간 간격으로 표준 조건(2D)에서 배양하고 추가 분석을 위해 -20°C에서 저장한다.
- 24시간 간격으로 표준 조건(3D)에서 배양된 캡슐화된 7PA2 세포로부터의 샘플 세포 배양 배지를 추가 분석을 위해 -20°C에서 저장하였다.
- 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 수집된 컨디셔닝 된 매체로 7PA2 세포로부터 Aβ의 분비를 검출한다(그림 4).
- 관련 응용 분야에서 추가 연구를 위해 마이크로 비드를 사용합니다.
참고: 캡슐화된 7PA2 세포는 임의의 또는 모델에서 지속적인 Aβ 분비의 효과를 평가하는데 사용될 수 있다.- 뇌의 쥐 해마 내의 미생물 생착의 경우, 쥐 뇌의 1mm 두께의 관상 동맥 절편을 생성하고수술 도구를 사용하여 원하는 부위에 마이크로 비드를 삽입합니다 (그림 5).
- 관심 있는 생체 분자의 지속적인 방출을 평가하기 위해 기재된 프로토콜에 따라 알긴산 마이크로비드에서 상이한 세포 유형을 캡슐화한다. 관련 시험관 내 및 생체내 시스템은 추가로 모델링될 수 있다.
- 유세포분석 및/또는 면역형광을 사용하여 캡슐화된 세포의 막 결합 마커의 발현을 감지합니다.
참고: 종양 질량 성장 및 바이오마커 발현의 초기 단계를 모델링하는 마이크로비드의 제조를 위한 유사한 방법의 사용의 예는 Rios 20에의해 설명된다.
Representative Results
7PA2 세포는 알긴산 마이크로비드에 성공적으로 캡슐화됩니다.
제조 후, 균일하고 구형 알긴산 마이크로비드는 이 프로토콜을 사용하여 성공적으로 생성된다. 아래 그림 2A의 이미지는 매개 변수 중 하나(즉, 전압)를 변경하여 알긴산 방울 스트림의 흐름과 분산을 변경하는 방법의 예를 보여줍니다. 그림 2 B는 겔화 과정 직후에 얻어진 알긴산 비드의 예를 나타낸다.
그림 2 : 제작 방법 최적화. (A) 스트림 분산의 변화를 보여주는 사진입니다. (B) 제조 직후 알긴산 구형 마이크로비드를 보여주는 밝은 필드 이미지. (C) 최적화 단계의 예: 표적 미생물 크기를 달성하기 위해 선택된 제조 파라미터를 튜닝한다. 선택된 그래프는 각 파라미터와 결과 마이크로비드의 크기(적어도 n=100 마이크로비드로부터의 크기 분포)의 관계를 설명한다. 노즐 내부 직경, 배출 된 용액의 점도 및 겔화 조건은 제조 된 비드의 크기에도 영향을 줄 수 있습니다. 오류 막대는 S.D.를 나타내며 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
기재된 프로토콜은 유연하고 알긴산 계 마이크로비드의 다양한 크기의 제조를 허용하며, 용도에 따라 조성이 다양하다. 그림 2C에서는300 μm 노즐을 통해 압출된 HEPES(pH 7.2)에서 2%(w/v) 알긴산 용액을 사용하여 미생물 크기에 대한 알긴산 유량, 전압 및 주파수의 영향을 보고합니다.
이 연구의 범위는 쥐 뇌 내에 내장 될 수있는 마이크로 비드를 생산하는 것이었기 때문에, 우리는 500-600μm의 범위에서 평균 미생물 직경을 얻기 위해 제조 매개 변수를 조정했습니다. 품질 관리를 위해 이 방법은 제작된 비드(즉, 좁은 크기 분포)의 모집단 전체에 걸쳐 최소한의 가변성을 갖도록 최적화되었습니다. (1) 생산된 비드는 20G 바늘을 장착한 해밀턴 주사기를 사용하여 쥐 뇌에 주입될 수 있음; 그리고 (2) 쥐 뇌의 한 반구는이 크기의 두 개 또는 세 개의 구슬까지 호스트 할 수 있습니다.
최적화 후, 7PA2 세포를 1.5 x 106 세포/mL의 농도로 캡슐화하여 HEPES로 완충한 알긴산 용액을 2% (w/v)에 부유시키고 0.5 M 염화칼슘 겔화 욕조에 떨어뜨리면서 원하는 마이크로비드를 산출하였다. 그림 3 아래는 표준 세포 배양 조건에서 하루 후 마이크로비드에 고르게 분포된 캡슐화된 7PA2 세포를 나타낸다. 7PA2 세포 증식은 제조사의 프로토콜에 따라 MTS 분석실험을 사용하여 시험되었다. 7일 동안 알긴산유무에 관계없이 성장한 7PA2 세포의 거동간에 유의한 차이가 없었다(그림3B). 표준 배양 조건에서 캡슐화된 세포를 인큐베이션할 때, 세포는 실험의 지속 기간 동안 계속 증식할 것으로 예상되며, 다른 작업28에보고된 바와 같이 작은 정도의 세포 탈출이 그 결과로 예상될 수 있다. 이것의 효과 작은 세포 밀도에 캡슐화 또는 마이크로 비 드 배양 되는 혈 청 농도 감소 하 여 완화 될 수 있다.
그림 3 : 캡슐화된 7PA2 셀. (a) 알긴산 미생물 전체에 걸쳐 균등한 세포 분포를 나타내는 캡슐화된 7PA2 세포의 밝은 필드 이미지. 제조 파라미터는 비드당 ~150~7PA2 셀을 수득하도록 설정하였다. 알긴산 비드의 유의한 변화는 7일 동안 배양에 걸쳐 관찰되지 않았다. (b) 알긴산 없이 배양된 세포대 알긴산으로 배양된 7PA2 세포의 전반적인 증식 사이에 관찰된 차이는 없었다. 7PA2 세포는 알긴산 구슬의 부피를 통해 성장하고 이동; 혈 청 농도의 감소 세포 성장 을 느리게 간주 될 수 있다. 오류 막대는 S.D.를 나타내며 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
7PA2 세포를 캡슐화하는 알긴산 마이크로비드는 시간이 지남에 따라 안정적입니다.
얻어진 알긴산 마이크로비드의 크기 및 형상을 조사하기 위해, 현미경 분석은 제조 및 겔화 후에 수행되었다. 선택된 프로토콜을 사용하여 수득된 마이크로비드의 평균 직경은 550±2 μm이다.
이론적으로, 550 μm 직경 의 미생물에서 예상되는 세포의 수는 다음과 같이 계산될 수 있습니다:
여기서 V = 볼륨 및 r = 반지름. 단일 마이크로비드의 부피는 V = 8.8 x 10-5 mL; 따라서 캡슐화 시 미생물당 세포 수 = (1.5 × 106) x (8.8 x 10-5) 130 셀.
실험적으로, 우리는 제조 직후 캡슐화된 세포의 수를 계산했습니다. 알긴산 비드는 용해 혼합을 사용하여 부드럽게 중단되었고 세포는 트라이판 블루 용액으로 염색하였다. 세포의 생존성 추정 및 계수를 혈세포계를 사용하여 수행하였다; 얻어진 결과는 미생물당 평균 116±17 의 살아있는 세포를 나타내었다(n=5, 보고되지 않은 데이터). 예상대로, 캡슐화 직후 이론적 세포 수와 실험 세포 수 사이의 사소한 차이가 관찰되었다. 일부 응용 의 경우, 특히 시간이 지남에 따라 방출 된 Aβ의 양을 결정하기 위해, 각 알긴산 비드에 캡슐화 된 세포의 수를 예측하는 것이 중요하다.
흥미롭게도, 캡슐화 과정은 세포 생존에 큰 영향을 미치지 않는다. 결과는 대장암세포(즉, HCT-116)가 유사한 방법을 사용하여 캡슐화되었고, 2D 대조군20에비해 알긴산 마이크로비드에서의 세포 생존가능성에 차이가 없는 전작에서 보고되었다.
캡슐화 공정에 사용되는 알긴산의 안정성을 측정하기 위해 14일 기간(n = 100)에 걸쳐 미생물 직경을 측정했습니다. 캡슐화 직후와 비교하여 캡슐화 후 14일 후 평균 직경에서 관찰된 변화는 없었다(데이터는 보고되지 않음).
캡슐화된 7PA2 세포는 시간이 지남에 따라 Aβ를 방출합니다.
7PA2 세포의 2D 및 3D 배양으로부터 분석된 컨디셔닝 된 배지는 Aβ1-42 수준에서 지속적인 증가를 나타냅니다. 세포 배양 배지는 24시간마다, 최대 4일간 샘플링하고, ELISA를 사용하여 분석하였다. 우리의 데이터는 마이크로비드(3D)로부터의 Aβ1-42의 방출 속도가 2D 배양으로부터 방출된것과 프로파일에서 유사하다는 것을 보여준다(도 4).
그림 4 : 7PA2 세포에서 Aβ1-42 분비속도. (A) 2D 및 3D 체외 모델에서 Aβ 방출(4일 후 규제%) 유사한 프로파일을 갖는다. 두 모델 모두 4일 동안 Aβ 수치가 지속적으로 증가하고 예상대로 꾸준한 농도에 도달하지 못하는 것으로 나타났습니다. (b) Aβ1-42의 농도는 초기 세포 번호로 정규화되고, 배양 방법에 관계없이 시간이 지남에 따라 Aβ1-42의 유사한 분비를 나타냈다. 알긴산의 존재도 캡슐화 과정 (3D 체외 모델) Aβ1-42의분비를 변경하지 않습니다. 오류 막대는 S.D.를 나타내며 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
캡슐화 된 7PA2 세포의 잠재적 인 응용 프로그램
우리는 알긴산 마이크로비드에 캡슐화된 7PA2 세포가 Aβ1-42의서방성 방출에 효과적으로 사용될 수 있으며, 따라서 모든 전임상 모델에서 만성 Aβ 분비의 효과를 테스트하는 데 사용될 수 있다고 보고하였다. 아래 그림 5에서는 쥐의 뇌 내에 쉽게 주입되고 위치할 수 있는 알긴산 마이크로비드를 사용하는 장점을 보여줍니다. Ex vivo 섹션은 여기에 삽화 목적을 위해 사용되며, 밀리미터 알긴산 비드와 제조된 알긴산 마이크로비드를 비교합니다.
그림 5 : 관련 전임상 용도에 마이크로비드 사용 쥐 두뇌에 있는 생착을 위한 마이크로비드는 두뇌 자영에 손상을 피하기 위하여 너무 큰 병변을 생성하지 않고 포함될 수 있을 만큼 작아야 하고 정상 두뇌 기능에 불리하게 영향을 미칩니다. 이미지(A)는 밀리미터 크기의 비드와 마이크로미터 크기의 비드 를 나란히 비교한 것을 보여줍니다. (B) 생체 내에서 목적을 위해 뇌 내에 밀리미터 크기의 비드를 이식하는 것은 작동하지 않을 것이다. 이미지(C)는 이 프로토콜을 사용하여 제조된 마이크로비드를 나타낸다. 크기는 정상적인 생리학에 해로운 영향을 미치지 않고 쥐의 해마 내 삽입에 적합합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
위의 이미지는 이러한 연구를 위한 미생물의 크기를 제어하는 것의 중요성을 강조합니다. 여기서, 우리는 600 μm 이하의 직경의 마이크로비드를 사용하는 이점을 입증한다. 이것은 최소 침습 주입의 사용을 허용합니다 (예를 들어, 해밀턴 주사기) 더 나은 뇌 내에서 주입 된 구슬의 위치를 제어 할 수 있습니다.
요약하면, 7PA2 세포를 캡슐화하면 마이크로비드의 크기, 캡슐화된 세포의 수 및 마이크로비드로부터 분비된 Aβ의 예측(예를 들어, 농도, 방출 프로파일)에 대한 제어를 제공한다. 마이크로비드의 크기를 제어하는 것은 두 가지 이유로 필수적입니다: 1) 방출된 Aβ의 농도에 대한 미세 조정 된 제어를 허용하고, 2) 쥐 뇌의 제어 영역에 이식을 허용합니다. 여기에서 얻은 결과는 알긴산 마이크로비드의 허실한 튜닝을 설명하고 추가 연구를 위한 잠재적인 적용을 강조합니다.
Discussion
이 문서에 설명된 방법은 알긴산 마이크로비드(27)의 좁은 크기분포를 달성하는 세포를 캡슐화하는 데 유용하다. 또한 면역 절연 환경17,19에서세포를 성장시키는 이점을 제공하므로 외부 스트레스로부터 보호합니다. 추가적으로, 알긴산에 있는 세포의 캡슐화는 더 밀접하게 생리적인 조건을 모방합니다, 특히 세포 대 세포 상호 작용 및 매트릭스 강성에 관하여20. 이들 인자는 모두 생체 내 생착과 같은 관련 적용에서 후속 사용에 특히 중요하며, 주변 조직에서 잠재적인 면역 반응을 배제한다17. 더욱이, 이 프로토콜의 주요 장점은 관심의 적용에 따라 쉽게 튜닝할 수 있다는 것이다: 프로토콜을 수정하고 더 크거나 작은, 더 부드럽고 단단한 비드의 제조를 위한 파라미터를 최적화할 수 있다. 기재된 방법은 최소 침습적 방법으로 주입될 수 있을 만큼 작은 비드를 제조하는 데 사용되며, 다수의 세포를 호스트할 수 있을 만큼 충분히 크고 관찰 가능한 행동 및 병리학적 효과를 초래하기 위해 Aβ의 충분한 방출을 제공하는 데 사용됩니다. 동물 모델에 주입시.
이 프로토콜의 성공은 여러 가지 중요한 단계에 따라 달라집니다. 신중한 세포 처리 및 최적의 세포 배양 기술은 세포 생존력과 기능20,28을유지하는 데 중요합니다. 표준 배양 조건을 사용하면 관찰된 바와 같이 7PA2 세포의 정상 기능 보존을 보장합니다. 이는 2D 배양체와 비교할 때 캡슐화된 세포로부터 Aβ1-42에 대한 유사한 방출 프로파일을 허용한다. 또한 프로토콜이 최적으로 작동하려면 점도가 낮은 알긴산 용액이 고점도 알긴산 용액에 비해 더 나은 결과를 보장합니다. 이는 균일한 층상 제트가 제조된 비드(27)의 매트릭스 내의 노즐 및 균등한 분포를 통해 압출되도록 한다. 세포를 캡슐화하는 데 사용되는 물질은 모양의 보존을 허용하는 매우 빠른 겔화 메커니즘을 가져야합니다.
이 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 겔화 다음 날조 된 마이크로 비드의 처리입니다. 여기서, 우리는 구슬을 전송하기 위해 큰 조리개 플라스틱 파이펫을 사용하여 마이크로 비드의 검색을 보여줍니다. 대안적으로, 마이크로비드를 함유하는 염화칼슘 용액을 메쉬 필터에 붓는 것은 비드 회수에 사용될 수 있다. 대형(5, 10 또는 25mL) 혈청학적 파이펫을 사용하여 마이크로비드를 그린 다음 붓는 대신 메쉬 필터를 통해 세척할 수 있습니다. 이것의 장점은 붓는 것에 비해 절차의 불임에 대한 신뢰도가 높다는 것입니다. 그러나, 한계의 경우 일부 비드는 피펫에 의해 압축되는 경우 왜곡될 수 있으며, 많은 양의 마이크로비드가 구출되지 않으면 더 낮은 수율을 위험에 빠뜨릴 수 있다.
이 접근법은 상이한 질병을 모델링하고 연구하기 위해 상이한 세포주를 캡슐화하는 데 사용되었습니다(예를 들어, 캡슐화된 췌도로부터의 인슐린 방출). 우리의 접근의 참신은 생체 내에서 알츠하이머 병의 중요한 측면을 모델링하는 유용한 방법으로이 프로토콜을 사용하여 생성 된 마이크로 비드의 생착이다. 캡슐화된 세포로부터 Aβ의 방출 프로필을 비교할때(도 4) 볼루스 주사에 의해 생성된 Aβ의 수준(예: 다른 연구에서 보고된 것과 같은3,26),Aβ의 보다 만성적이고 지속적인 방출이 될 수 있다. 예상. 도 6은 달성될 수 있는 예측 경향을 도시한다. 생체 내 모델링을 위해 이 시스템을 사용하는 것은 질병이 진행되는 방식과 더 관련이 있으며 약물 발견 및 개발에 더 유용할 수 있습니다.
그림 6 : 볼루스 주사와 비교하여 캡슐화된 7PA2 세포로부터 Aβ1-42의 방출 프로파일을 예측하였다. 생착식 된 7PA2 함유 마이크로 비드에서 Aβ 방출의 프로파일은 AD에 대한 관련성의 동물 모델에서 만성 및 지속Aβ의 효과를 테스트 할 수 있습니다. 반대로, 볼루스 주사는 짧은 기간 동안 Aβ 수준에 있는 스파이크를 만들고, 두뇌에서 Aβ의 급속한 정리에 선행될 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 알긴산 미생물 제조, 세포 배양 및 Aβ 검출, 유용한 과학적 인의 최적화에 도움을 미스터 카젠 Suresparan, 박사 조나단 우베투, 미스터 도미닉 그루진스키, 미스 첸 자오, 박사 티에리 파일럿에게 감사드립니다 토론.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µManager software | Vale Lab, UCSF, USA | v.1.46 | |
| 0.22 um PES filter | Merck, UK | SLGP033RS | |
| 15mm Netwell insert 74 um mesh filter | Constar, usa | #3477 | |
| Alginic acid sodium salt from brown algae | Sigma-Aldrich,uk | A0682 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich,uk | C1016 | |
| CellTiter96 AQueous One Solution cell proliferation assay | Promega, USA | G3580 | |
| Encapsulator | Inotech | IE-50 | serial no. 05.002.01-2005 |
| HEPES | Sigma-Aldrich,uk | H4024 | |
| Hu Aβ 1-42 ELISA | ThermoFisher, UK | KHB3441 | |
| ImageJ software | ImageJ | v1.49p | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | |
| Leica microscope | Leica microsystems, UK | DMI6000B | |
| Neo sCMOS Camera | Ander, UK | 5.5 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich,uk | D1408 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich,uk | 433209 | |
| Trispdium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich,uk | W302600-K | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich,uk | T4049 |
References
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