دراسة ديناميات الأعضاء في الخلايا B أثناء تكوين المشبك المناعي
Summary
هنا نقوم بوصف نهجين لتوصيف أحداث استقطاب الخلايا في الخلايا الليمفاوية B أثناء تشكيل IS. الأول، ينطوي على التحديد الكمي للتوظيف الجهازي وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي في الغشاء متشابك. والثاني هو نهج البيوكيميائية، لتوصيف التغيرات في تكوين سنتروسوم، الذي يخضع للاستقطاب إلى متشابك المناعة.
Abstract
التعرف على المستضدات المربوطة بالسطح بواسطة مستقبلات الخلايا B (BCR) يؤدي إلى تشكيل متشابك المناعة (IS)، حيث يتم تنسيق كل من الإشارات ومستضد. تشكيل IS ينطوي على إعادة عرض الأكتين ديناميكية يرافقه تجنيد الاستقطاب إلى غشاء متشابك من العضيات داخل الخلايا المركزية وما يرتبط بها مثل الليسوسوم وجهاز غولجي. المراحل الأولية من إعادة عرض الأكتين تسمح للخلايا B لزيادة سطح الخلية وتعظيم كمية من المجمعات مستضد-BCR التي تم جمعها في متشابك. في ظل ظروف معينة، عندما تعترف الخلايا B المستضدات المرتبطة بالأسطح الصلبة، وتقترن هذه العملية إلى التوظيف المحلي وإفراز الليسوسوم، والتي يمكن أن تسهل استخراج المستضد. يتم استيعاب المستضدات المركبة في مقصورات داخلية ومتخصصة للمعالجة في الببتيدات، والتي يتم تحميلها على الجزيئات الرئيسية مجمع التوافق النسيجي الثاني (MHC-II) لمزيد من العرض إلى خلايا مساعد T. لذلك، دراسة ديناميات الجهاز ية المرتبطة بتكوين IS أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية تنشيط الخلايا B. في هذه المقالة سوف نناقش كل من التصوير وتقنية البيوكيميائية المستخدمة لدراسة التغيرات في تحديد المواقع داخل الخلايا الأعضاء وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي التي ترتبط مع تشكيل IS في الخلايا B.
Introduction
الخلايا الليمفاوية B هي جزء أساسي من الجهاز المناعي التكيفي المسؤول ة عن إنتاج الأجسام المضادة ضد التهديدات المختلفة ومسببات الأمراض الغازية. يتم تحديد كفاءة إنتاج الأجسام المضادة من خلال قدرة الخلايا B على الحصول على، ومعالجة وتقديمالمستضدات التي تواجهها إما في شكل قابل للذوبان أو سطح المربوطة 1،2. التعرف على المستضدات المتصلة بسطح خلية تقديم، من قبل BCR، يؤدي إلى تشكيل اتصال قريب بين الخلايا يسمى IS3،4. داخل هذه المنصة الديناميكية يتم كل من الإشارات النهائية المعتمدة على BCR واستيعاب المستضدات في مقصورات بطانة اللمعة. تتم معالجة المستضدات التي يتم التقاطها وتجميعها على جزيئات MHC-II وتقدم بعد ذلك إلى الخلايا الليمفاوية T. التفاعلات المنتجة B-T، ودعا B-T خلية التعاون، والسماح للخلايا الليمفاوية B لتلقي الإشارات المناسبة، والتي تعزز تمايزها في خلايا البلازما المنتجة للأجسام المضادة أو خلايا الذاكرة8.
وقد شاركت آليتان في استخراج المستضد من قبل الخلايا B. الأول يعتمد على إفراز البروتياز الناشئة من الليسوسوم التي تخضع للتجنيد والانصهار في مشقوق متشابك5،6. والثاني، يعتمد على قوات سحب Myosin IIA بوساطة التي تؤدي إلى التهاب المهبل من مستضد يحتوي على الأغشية التي يتم استيعابها في حفر المغلفة clathrin7. يعتمد وضع استخراج المستضد على الخصائص الفيزيائية للغشاء الذي توجد فيه المستضدات. ومع ذلك، في كلتا الحالتين، تخضع الخلايا B لحدثين رئيسيين لإعادة تشكيل هما: إعادة تنظيم الهيكل الخلوي للأكتين واستقطاب العضيات إلى تنظيم الدولة الإسلامية. إعادة عرض الهيكل الخلوي أكتين ينطوي على مرحلة الانتشار الأولية، حيث نتوءات تعتمد على الأكتين في الغشاء متشابك زيادة السطح في اتصال مع مستضد. ويلي ذلك مرحلة انكماش، حيث تتركز الـ BCRs إلى جانب المستضدات في مركز IS من خلال العمل المتضافر للمحركات الجزيئية وإعادة تشكيل الهيكل الخلوي للأكتين8،9،10، 11.الاستقطاب من العضيات يعتمد أيضا على إعادة تشكيل الهيكل السيتوهيكل الأكتين. على سبيل المثال ، يصبح السنتروسوم غير مرتبط من النواة ، عن طريق إزالة البلمرة المحلية من الأكتين المرتبطة بها ، والذي يسمح بإعادة تمركز هذه الجهازية إلى IS5،12. في الخلايا B، إعادة وضع سنتروسوم إلى عمود خلية واحد (IS) يرشد التوظيف اللايسوم إلى الغشاء متشابك، والتي عند إفراز يمكن أن تسهل استخراج و / أو معالجة المستضدات المربوطة السطحية6. يتم إثراء Lysosomes المعين في IS مع MHC-II، الذي يفضل تشكيل المجمعات الببتيد MHC-II في مقصورات بطانة الرحم لتقديمها إلى الخلايا T13. بالإضافة إلى ذلك، لوحظ أيضا أن جهاز غولجي يتم تجنيده عن كثب إلى IS14،مما يشير إلى أن الحويصلات المستمدة من غولجي من المسار السري يمكن أن تشارك في استخراج مستضد و / أو معالجة.
وإجمالاً، فإن إعادة ترتيب الأعضاء داخل الخلايا والهيكل الخلوي في الخلايا B أثناء تكوين المشبك هي الخطوات الرئيسية التي تسمح باكتساب المستضد بكفاءة ومعالجتها اللازمة لمزيد من التنشيط. في هذا العمل نقدم بروتوكولات مفصلة حول كيفية إجراء التصوير والتحليل البيوكيميائي في الخلايا B لدراسة إعادة عرض داخل الخلايا من العضيات المرتبطة بتكوين IS. وتشمل هذه التقنيات ما يلي: ‘1’ الفلورة المناعية وتحليل الصور للخلايا باء المنشطة بالخرز المغلف بالمستضد وعلى الأغطية المغلفة بالمستضد، مما يسمح بالتصور والتحديد الكمي للمكونات داخل الخلايا التي يتم تعبئتها إلى IS و(ii) ) عزل الكسور ذات الثراء المركزي في الخلايا B عن طريق التدرجات الفائقة على تدرجات السكروز، مما يسمح بتحديد البروتينات المرتبطة بالمركزية، والتي يحتمل أن تشارك في تنظيم قطبية الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن نصف طريقة شاملة لدراسة كيفية إعادة تنظيم الخلايا الليمفاوية B الهندسة المعمارية داخل الخلايا لتعزيز تشكيل IS. وتشمل هذه الدراسة استخدام تقنيات التصوير لتحديد كمية التوزيع داخل الخلايا من العضيات، مثل سنتروسوم، جهاز غولجي والليسوسوم خلال تنشيط الخلية B، وكيف أنها الاستقطاب إلى IS. بالإ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-I.Y. مدعوم بمنحة بحثية من FONDECYT #1180900. وحظيت كل من لجنة الدراسات الدولية ووزارة العدل وشركة J.L. بدعم من زمالات من اللجنة الوطنية للعلوم والتكنولوجيا. نشكر ديفيد أوسوريو من جامعة بونتيفيسيا الكاثوليكية في شيلي على تسجيل الفيديو وتحريره.
Materials
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
- Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
- Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
- Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
- Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
- Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
- Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
- Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
- Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
- Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
- Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
- Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
- Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
- Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, (2015).
- Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
- Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).
