Étudier la dynamique d'Organelle dans les cellules B pendant la formation immunitaire de synapse
Summary
Ici nous décrivons deux approches pour caractériser des événements de polarisation de cellules dans les lymphocytes de B pendant la formation d’un IS. La première, implique la quantification du recrutement d’organites et des réarrangements de cytosquelette à la membrane synaptique. La seconde est une approche biochimique, pour caractériser les changements dans la composition du centrosome, qui subit une polarisation à la synapse immunitaire.
Abstract
La reconnaissance des antigènes attachés de surface par le récepteur des cellules B (BCR) déclenche la formation d’une synapse immunitaire (IS), où la signalisation et l’apport d’antigènes sont coordonnés. La formation d’IS implique le remodelage dynamique d’actine accompagné du recrutement polarisé à la membrane synaptique des organites intracellulaires centrosomes et associés tels que des lysosomes et l’appareil de Golgi. Les premières étapes du remodelage de l’actine permettent aux cellules B d’augmenter leur surface cellulaire et de maximiser la quantité de complexes antigènes-BCR recueillis à la synapse. Dans certaines conditions, lorsque les cellules B reconnaissent les antigènes associés aux surfaces rigides, ce processus est couplé au recrutement local et à la sécrétion de lysosomes, ce qui peut faciliter l’extraction d’antigènes. Les antigènes pris sont intériorisés dans des compartiments endo-lysosome spécialisés pour le traitement en peptides, qui sont chargés sur des molécules majeures du complexe d’histocompatibilité II (MHC-II) pour une présentation ultérieure aux cellules d’aide T. Par conséquent, l’étude de la dynamique des organites associée à la formation d’un SI est cruciale pour comprendre comment les cellules B sont activées. Dans le présent article, nous discuterons à la fois de l’imagerie et d’une technique biochimique utilisée pour étudier les changements dans le positionnement intracellulaire des organites et les réarrangements cytosquelettes qui sont associés à la formation d’un IS dans les cellules B.
Introduction
Les lymphocytes B sont une partie essentielle du système immunitaire adaptatif responsable de la production d’anticorps contre différentes menaces et d’envahissement des agents pathogènes. L’efficacité de la production d’anticorps est déterminée par la capacité des cellules B à acquérir, traiter et présenter les antigènes rencontrés sous une forme soluble ou en surface1,2. La reconnaissance des antigènes attachés à la surface d’une cellule de présentation, par le BCR, conduit à la formation d’un contact intercellulaire étroit appelé IS3,4. Dans cette plate-forme dynamique, la signalisation en aval dépendante de BCR et l’internalisation des antigènes dans les compartiments endo-lysosome ont lieu. Les antigènes pris sont traités et assemblés sur des molécules MHC-II et ensuite présentés aux lymphocytes T. Les interactions productives B-T, appelées coopération de cellules B-T, permettent aux lymphocytes B de recevoir les signaux appropriés, qui favorisent leur différenciation en cellules plasmatiques productrices d’anticorps ou cellules de mémoire8.
Deux mécanismes ont été impliqués dans l’extraction d’antigènes par les cellules B. La première s’appuie sur la sécrétion de protéases issues de lysosomes qui subissent le recrutement et la fusion à la fente synaptique5,6. Le second, dépend des forces de traction Myosin IIA-négociées qui déclenche l’invagination de l’antigène contenant des membranes qui sont intériorisées dans des fosses enduites de clathrine7. Le mode d’extraction d’antigènes repose sur les propriétés physiques de la membrane dans laquelle se trouvent les antigènes. Néanmoins, dans les deux cas, les cellules B subissent deux événements majeurs de remodelage : la réorganisation du cytosquelette d’actine et la polarisation des organites à l’IS. Le remodelage du cytosquelette d’Actin implique une étape initiale de propagation, où les protubérances actin-dépendantes à la membrane synaptique augmentent la surface en contact avec l’antigène. Elle est suivie d’une phase de contraction, où les BCR couplés avec des antigènes sont concentrés au centre de l’IS par l’action concertée des moteurs moléculaires et de cytosquelette d’actine transformant8,9,10, 11. La polarisation des organites repose également sur le remodelage du cytosquelette d’actine. Par exemple, le centrosome se découple du noyau, par dépolymérisation locale de l’actine associée, ce qui permet le repositionnement de cette organite à l’IS5,12. Dans les cellules B, le repositionnement du centrosome à un pôle cellulaire (IS) guide le recrutement lysosome à la membrane synaptique, qui sur la sécrétion peut faciliter l’extraction et/ou le traitement des antigènes de surface6. Les lysosomes recrutés à l’EI sont enrichis de MHC-II, qui favorise la formation de complexes peptide-MHC-II dans des compartiments endosomal s’ils seront présentés aux lymphocytes T13. En outre, l’appareil Golgi a également été observé pour être étroitement recruté à l’IS14, suggérant que les vésicules golgi-dérivées de la voie sécrétrice pourraient être impliquées dans l’extraction et/ou le traitement d’antigène.
Au total, les réarrangements intracellulaires d’organelle et de cytosquelette dans les cellules De B pendant la formation de synapse sont les étapes principales qui permettent l’acquisition et le traitement efficaces d’antigène exigés pour leur activation plus loin. Dans ce travail, nous introduisons des protocoles détaillés sur la façon d’effectuer l’imagerie et l’analyse biochimique dans les cellules B pour étudier le remodelage intracellulaire des organites associés à la formation d’un IS. Ces techniques comprennent : (i) Immunofluorescence et analyse d’image des cellules B activées avec des perles enduites d’antigène et sur des couvertures enduites d’antigène, ce qui permet la visualisation et la quantification des composants intracellulaires qui sont mobilisés vers l’IS et (ii ) l’isolement des fractions centrosome-enrichies dans les cellules De B par ultracentrifugation sur des gradients de saccharose, qui permet l’identification des protéines liées au centrosome, potentiellement impliquées dans la régulation de la polarité cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons une méthode complète pour étudier comment les lymphocytes B réorganisent leur architecture intracellulaire pour favoriser la formation d’un IS. Cette étude comprend l’utilisation de techniques d’imagerie pour quantifier la distribution intracellulaire des organites, tels que le centrosome, l’appareil Golgi et les lysosomes pendant l’activation des cellules B, et comment ils se polarisent vers l’IS. En outre, nous décrivons une approche biochimique pour étudier des changements dans la composition de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-I.Y. bénéficie d’une subvention de recherche de FONDECYT #1180900. J.I., D.F. et J.L. ont été soutenus par des bourses de la Comision Nacional de Ciencia y Tecnologa. Nous remercions David Osorio de Pontificia Universidad Cataliica de Chile pour l’enregistrement et le montage vidéo.
Materials
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
- Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
- Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
- Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
- Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
- Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
- Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
- Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
- Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
- Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
- Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
- Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
- Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
- Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, (2015).
- Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
- Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).
