Immün SYNAPSE oluşumu sırasında B hücrelerinde organelle dinamikleri eğitimi
Summary
Burada bir IS oluşumu sırasında B lenfositlerinde hücre kutuplaşma olaylarını karakterize etmek için iki yaklaşım açıklanmaktadır. İlk olarak, sinaptik membranda organel işe alma ve sitroiskelet yeniden düzenlemelerinin ölçülmesini içerir. İkinci bir biyokimyasal yaklaşım, sentez bileşiminde değişiklikleri karakterize etmek, hangi bağışıklık sinaps için polarizasyon uğrar.
Abstract
B hücresi reseptörü (BCR) tarafından yüzeye bağlı antijenlerin tanınması, hem sinyalizasyon hem de antijen alımı koordine edilen bir bağışıklık sinapse (IS) oluşumunu tetikler. Is oluşumu, centrosome ve lisosomlar ve Golgi aparatları gibi hücre içi organellerin sinaptik membranına polarize işe alımı ile birlikte dinamik aksinlerin yeniden biçimlendirilmesi içerir. Aktin remodeling ilk aşamaları B hücreleri kendi hücre yüzeyini artırmak ve antijen-BCR kompleksler sinaps toplanan miktarını maksimize izin verir. Belirli koşullar altında, B hücreleri sert yüzeylerle ilişkili antijenleri tanırken, bu süreç antijen ekstraksiyonu kolaylaştırabilen liksosomların yerel işe alma ve salgılanmasını birleştirilmiştir. Alınan antijenler, büyük histouyumluluk kompleksi II (MHC-II) molekülleri T helper hücrelerine daha fazla sunum için yüklü peptitler içine işleme için özel Endo-lysosome bölmeleri içine emdirilmiş vardır. Bu nedenle, bir IS oluşumu ile ilişkili organel dinamikleri eğitim B hücrelerinin nasıl aktif olduğunu anlamak için çok önemlidir. Bu yazıda hem görüntüleme hem de hücre içi organel konumlandırma ve B hücrelerinde bir IS oluşumu ile ilişkili siterografi yeniden düzenlemeleri değişiklikleri incelemek için kullanılan bir biyokimyasal tekniği tartışacağız.
Introduction
B lenfositler farklı tehditler ve istila patojenlere karşı antikorlar üreten sorumlu adaptif bağışıklık sisteminin önemli bir parçasıdır. Antikor üretiminin verimliliği, B hücrelerinin elde edilmesi, işleyişlerine ve mevcut antijenlere, çözünür veya yüzeye bağlı bir formda1,2‘ de karşılaşılan yeteneğine göre belirlenir. Sunma hücresinin yüzeyine bağlı antijenlerin tanınması, BCR tarafından, yakın bir hücresel temas oluşumuna yol açar3,4. Bu dinamik platformda BCR ‘ye bağımlı akım sinyalizasyon ve antijenlerin Endo-lysosome bölmeler içine inilemasyonu gerçekleşir. Alınan antijenler MHC-II molekülleri üzerine işlenmiş ve monte edilir ve daha sonra T lenfositlerine sunulmuştur. Üretken B-T etkileşimleri, B-T hücre işbirliği olarak adlandırılan, B lenfositlerin antikor üreten plazma hücreleri veya bellek hücreleri içine farklılaşma teşvik uygun sinyalleri almak için izin8.
İki mekanizma B hücreleri tarafından antijen ekstraksiyon dahil edilmiştir. Birincisi Sinaptik yarık5,6‘ da işe alma ve füzyon geçmesi lisosomlar kaynaklanan proteazların salgılanmasını dayanır. İkincisi, Myosin ııA-mediated Çekme güçleri bu Clathrin kaplı çukurları içine oyulmuş olan antijen içeren membranların invaginasyon tetikler bağlıdır7. Antijenlerin bulunduğu membranın fiziksel özelliklerine antijen ekstraksiyon modu dayanır. Yine de, her iki durumda da, B hücreleri iki büyük remodeling olaylar geçmesi: aktin siterit yeniden yapılanma ve Is için organizler kutuplaşma. Actin sitroiskelet remodeling, sinaptik membranda akin bağımlı çıkıntılar antijen ile temas yüzeyini artıran bir ilk yayılan aşama içerir. Bu bir kasılma aşaması tarafından izlenir, nerede BCrs antijenler ile birleştiğinde, molekül motorları ve aktin sitofülit remodeling tarafından uyumlu eylem tarafından merkezi yoğunlaşmıştır8,9,10, 11. organizasyonun polarizasyon da aktin sitajin remodeling dayanır. Örneğin, centrosome çekirdeğinden, ilişkili actin yerel depolimerizasyon tarafından, bu organel yeniden konumlandırılması için5,12sağlar tarafından unoupled olur. B hücrelerinde, bir hücre Kutbu centrosome yeniden konumlandırılması (IS) sinaptik membran için liksosome işe kılavuzları, hangi salgılanma üzerine çıkarma ve/veya yüzey-gergin antijenlerin işlenmesi kolaylaştırabilir6. Is ‘de istihdam edilen lysosomes, T hücrelerinin13‘ e sunulması için endosomal bölmeler içinde Peptide-MHC-II kompleksleri oluşumunu sağlayan MHC-II ile zenginleştirilmiştir. Ayrıca, Golgi aparatının da yakın Is14için işe olduğu gözlenmiştir, Golgi-sır yolu gelen veziküller antijen ekstraksiyon ve/veya işleme dahil olabileceğini düşündürmektedir.
Sinaps oluşumu sırasında B hücrelerinde hücre içi organel ve siteron yeniden düzenlemeleri, daha fazla aktivasyonu için gerekli olan verimli antijen alımı ve işlenmesine izin veren önemli adımlara sahiptir. Bu çalışmada, B hücrelerinde görüntüleme ve biyokimyasal analizlerin nasıl yapılacağı hakkında ayrıntılı protokoller tanıtmak, bir IS oluşumu ile ilişkili organellerin hücre içi remodeling çalışma. Bu teknikler şunlardır: (i) antijen kaplı boncuklar ile aktif B hücrelerinin Immünofluorescence ve görüntü analizi ve IS ve (ii) için seferber edilmiş hücre içi bileşenlerin görüntüleme ve ölçümleme sağlayan antijen kaplı kapak ) B hücrelerinde centrosome-zenginleştirilmiş fraksiyonları izolasyonlu, sukroz degradeler üzerinde ultracent, protein ile ilişkili proteinlerin tanımlanması, potansiyel Hücre polaritesi düzenleyen dahil sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
B lenfositlerinin bir IS oluşumunu teşvik etmek için hücre içi mimarisini nasıl yeniden organize ettiğini incelemek için kapsamlı bir yöntem tarif ediyoruz. Bu çalışmada, B hücresi aktivasyonu sırasında centrosome, Golgi aparatı ve lisosomlar gibi organellerin hücre içi dağılımını ölçmek için görüntüleme tekniklerini ve IS ‘e nasıl polarize edildiğini içerir. Ayrıca, B hücresi aktivasyonu üzerine centrosome bileşiminde değişiklikleri incelemek için bir biyokimyasal yaklaşım açı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-I.Y. FONDECYT #1180900 bir araştırma hibe tarafından desteklenmektedir. J.I., D.F. ve si., Comisión Nacional de ciencia y Tecnología ‘dan Burslar tarafından destekleniyor. Biz video kayıt ve düzenleme için Pontificia Universidad Católica de Chile David Osorio teşekkür ederiz.
Materials
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
- Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
- Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
- Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
- Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
- Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
- Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
- Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
- Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
- Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
- Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
- Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
- Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
- Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
- Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
- Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
- Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
- Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, (2015).
- Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
- Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
- Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).
