प्रतिरक्षा Synapse गठन के दौरान बी कोशिकाओं में Organelle गतिशीलता का अध्ययन
Summary
इसमें हम आईएस के गठन के दौरान बी लिम्फोसाइटों में कोशिका ध्रुवण की घटनाओं की विशेषता के लिए दो तरीकों का वर्णन करते हैं। पहला, ऑर्गेनेल भर्ती और साइटोस्केलेटन की मात्रा निर्धारण शामिल है, जो synaptic झिल्ली पर है। दूसरा एक जैव रासायनिक दृष्टिकोण है, सेंट्रोसोम की संरचना में परिवर्तन की विशेषता है, जो प्रतिरक्षा synapse के लिए ध्रुवीकरण से होकर गुजरती है.
Abstract
बी सेल रिसेप्टर (बीसीआर) द्वारा सतह-टेदरएंटीड एंटीजन की मान्यता एक प्रतिरक्षा synapse (आईएस) के गठन से चलाता है, जहां दोनों संकेतन और प्रतिजन तेज समन्वित कर रहे हैं। IS के गठन में गतिशील actin remodeling शामिल है, जिसमें सेंट्रोसोम और संबद्ध इंट्रासेल्यूलर ऑर्गेनेल्स जैसे लाइसोसोम और गोलगी उपकरण की synaptic झिल्ली के लिए polarized भर्ती के साथ। actin remodeling के प्रारंभिक चरणों बी कोशिकाओं को अपने सेल सतह को बढ़ाने के लिए और synapse पर इकट्ठा प्रतिजन-BCR परिसरों की मात्रा को अधिकतम करने के लिए अनुमति देते हैं। कुछ शर्तों के तहत, जब बी कोशिकाओं कठोर सतहों से जुड़े प्रतिजनों को पहचान, इस प्रक्रिया को स्थानीय भर्ती और lysosomes के स्राव के लिए युग्मित है, जो प्रतिजन निष्कर्षण की सुविधा कर सकते हैं. अपटेक्ड एंटीजन को पेप्टाइड्स में प्रसंस्करण के लिए विशेष एंडो-लाइसोमिक डिब्बों में आंतरिकीकृत किया जाता है, जो टी सहायक कोशिकाओं को आगे प्रस्तुति के लिए प्रमुख हिस्टोसंगतता जटिल द्वितीय (एमएचसी-II) अणुओं पर लोड किया जाता है। इसलिए, एक IS के गठन के साथ जुड़े organelle गतिशीलता का अध्ययन कैसे बी कोशिकाओं को सक्रिय कर रहे हैं समझने के लिए महत्वपूर्ण है. वर्तमान लेख में हम इमेजिंग और एक जैव रासायनिक तकनीक दोनों पर चर्चा करेंगे जो इंट्रासेल्यूलर ऑर्गेनिक पोजीशनिंग और साइटोस्केलेटन पुनर्व्यवस्थापन में परिवर्तन ों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है जो बी कोशिकाओं में आईएस के गठन से जुड़े हैं।
Introduction
बी लिम्फोसाइटों विभिन्न खतरों और हमलावर रोगजनकों के खिलाफ एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए जिम्मेदार अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली का एक अनिवार्य हिस्सा हैं। एंटीबॉडी उत्पादन की दक्षता बी कोशिकाओं को प्राप्त करने, प्रक्रिया करने की क्षमता द्वारा निर्धारित की जाती है और वर्तमान प्रतिजनों का सामना किसी घुलनशील या सतह से बने रूप1,2में होता है। बीसीआर द्वारा एक प्रस्तुत कोशिका की सतह से जुड़े एंटीजनों की पहचान, एक करीबी अंतरकोशिकीय संपर्क के गठन की ओर ले जाती है जिसे आईएस3,4कहा जाता है। इस गतिशील मंच के भीतर बीसीआर-निर्भर डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग और एंडो-लाइसोम डिब्बों में एंटीजन का आंतरिककरण दोनों जगह लेता है। अपटेककिए एंटीजन संसाधित किए जाते हैं और एमएचसी-II अणुओं पर इकट्ठे होते हैं और बाद में टी लिम्फोसाइटों को प्रस्तुत किए जाते हैं। उत्पादक बी-टी बातचीत, बी-टी सेल सहयोग कहा जाता है, बी लिम्फोसाइटों उचित संकेत प्राप्त करने के लिए अनुमति देते हैं, जो एंटीबॉडी उत्पादक प्लाज्मा कोशिकाओं या स्मृति कोशिकाओं8में उनके भेदभाव को बढ़ावा देने के।
बी कोशिकाओं द्वारा प्रतिजन निष्कर्षण में दो तंत्र शामिल किया गया है. पहला व्यक्ति लाइसोसोम से उत्पन्न प्रोटीज के स्राव पर निर्भर करता है जो सिनैप्टिक फांक5,6में भर्ती और संलयन से गुजरता है . दूसरा, मायोसिन आईआईए-मध्यस्थ पुलिंग बलों पर निर्भर करता है जो एंटीजन के आक्रमण को ट्रिगर करता हैजिसमें झिल्ली युक्त होती है जो क्लैथरिन लेपित गड्ढों में आंतरिक होती है। प्रतिजन निष्कर्षण का तरीका झिल्ली के भौतिक गुणों पर निर्भर करता है जिसमें एंटीजन पाए जाते हैं। फिर भी, दोनों ही मामलों में, बी कोशिकाओं दो प्रमुख remodeling घटनाओं से गुजरना: actin cytoskeleton पुनर्गठन और IS के लिए organelles के ध्रुवीकरण. Actin cytoskeleton remodeling एक प्रारंभिक प्रसार चरण है, जहां synaptic झिल्ली पर actin-निर्भर protrusions प्रतिजन के साथ संपर्क में सतह में वृद्धि शामिल है. यह एक संकुचन चरण के बाद है, जहां बीआरसी एंटीजन के साथ मिलकर आणविक मोटर्स और actin cytoskeleton remodeling8,9,10के ठोस कार्रवाई द्वारा IS के केंद्र में केंद्रित कर रहे हैं, 11organelles के ध्रुवीकरण भी actin cytoskeleton के remodeling पर निर्भर करता है. उदाहरण के लिए, सेंट्रोसोम नाभिक से अयुग्मित हो जाता है, संबद्ध एक्टिन के स्थानीय विबहुलकन द्वारा, जो इस ऑर्गेनेल को आईएस5,12में पुन: स्थापन करने की अनुमति देता है। बी कोशिकाओं में, एक सेल पोल (आईएस) के लिए सेन्ट्रोसोम की स्थिति synaptic झिल्ली के लिए lysosome भर्ती गाइड, जोस्राव पर निष्कर्षण और / आईएस में भर्ती लाइसोसोम एमएचसी-II से समृद्ध हैं, जो एंडोसोमल डिब्बों में पेप्टाइड-एमएचसी-II परिसरों के गठन के पक्ष में है जिसे टी सेल13में प्रस्तुत किया जाएगा। इसके अतिरिक्त, गोलगी उपकरण को भी आईएस14में निकट से भर्ती किया गया है, यह सुझाव देते हुए कि गुप्त मार्ग से गोलगी व्युत्पन्न vesicles एंटीजन निष्कर्षण और/या प्रसंस्करण में शामिल किया जा सकता है।
कुल मिलाकर, synapse गठन के दौरान बी कोशिकाओं में intracellular organelle और cytoskeleton पुनर्व्यवस्थामहत्वपूर्णता महत्वपूर्ण कदम है कि कुशल प्रतिजन अधिग्रहण और प्रसंस्करण उनके आगे सक्रियण के लिए आवश्यक अनुमति देते हैं. इस काम में हम एक IS के गठन के साथ जुड़े organelles के intracellular remodeling का अध्ययन करने के लिए बी कोशिकाओं में इमेजिंग और जैव रासायनिक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए कैसे पर विस्तृत प्रोटोकॉल परिचय। इन तकनीकों में शामिल हैं: (i) प्रतिजन लेपित मोतियों के साथ और एंटीजन लेपित कवरलिप्स के साथ सक्रिय बी कोशिकाओं का इम्यूनोफ्लोरेसेंस ेशन और छवि विश्लेषण, जो आईएस को जुटाने वाले इंट्रासेल्यूलर घटकों के दृश्य और परिमाणीकरण की अनुमति देता है और (ii ) सुक्रोज ग्रेडिएंट पर ultracentrifugation द्वारा बी कोशिकाओं में सेंट्रोसोम समृद्ध भिन्नों के अलगाव, जो सेंट्रोसोम के साथ जुड़े प्रोटीन की पहचान की अनुमति देता है, संभवतः सेल ध्रुवता को विनियमित करने में शामिल.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम अध्ययन करने के लिए एक व्यापक विधि का वर्णन कैसे बी लिम्फोसाइटों एक IS के गठन को बढ़ावा देने के लिए उनके intracellular वास्तुकला को फिर से व्यवस्थित. इस अध्ययन में बी सेल सक्रियण के दौरान आर्गेनेल्स के इंट्रासे…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.-I.Y. FONDECYT #1180900 से एक अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित है. J.I., D.F. और J.L. Comisi-n Nacional de Ciencia y Tecnologa से फैलोशिप द्वारा समर्थित थे. हम वीडियो रिकॉर्डिंग और संपादन के लिए Pontificia Universidad कैटेलिका डे चिली से डेविड Osorio को धन्यवाद.
Materials
| IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells | ATCC | TIB-208 | Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR |
| 100% methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular | Marienfield-Superior | 111500 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG | LifeTech | A21206 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11071 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A21238 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Amaxa Nucleofection kit V | Lonza | VCA-1003 | Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA |
| Amaxa Nucleofector model 2b | Lonza | AAB-1001 | Program L-013 used |
| Amino- Dynabeads | ThermoFisher | 14307D | |
| Anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-rab6 | Abcam | ab95954 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Anti-sec61 | Abcam | ab15575 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| BSA | Winkler | BM-0150 | |
| CaCl2 | Winkler | CA-0520 | |
| Culture plate T25 | BD | 353014 | |
| Fiji Software | Fiji col. | ||
| Fluoromount G | Electron Microscopy Science | 17984-25 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7651 | |
| Glycine | Winkler | BM-0820 | |
| Goat-anti-mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 315-005-003 | IIA1.6 positive ligand |
| Goat-anti-mouse IgM antibody | Thermo Fisher Scientific | 31186 | IIA1.6 negative ligand |
| HyClone Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | Heat inactivate at 56 oC for 30 min |
| KCl | Winkler | PO-1260 | |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica | ||
| NaCl | Winkler | SO-1455 | |
| Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope | Nikon | ||
| Parafilm | M | P1150-2 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Liquid |
| Polybead Amino Microspheres 3.00μm | Polyscience | 17145-5 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | Dilute with sterile water |
| Rabbit anti- alpha tubulin antibody | Abcam | ab6160 | 1:1000 dilution recommended but should be optimized |
| Rabbit anti mouse lamp1 antibody | Cell signaling | 3243 | 1:200 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit anti-cep55 | Abcam | ab170414 | 1:500 dilution recomended but should be optimized |
| Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody | Abcam | ab16504 | 1:1000 for Western Blot |
| RPMI-1640 | Biological Industries | 01-104-1A | |
| Saponin | Merck | 558255 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Sucrose | Winkler | SA-1390 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Tube 50 ml | Corning | 353043 |
References
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