Udforskning sekvens plads til at identificere bindende sites for regulerende RNA-bindende proteiner

Summary

Sekvens specificitet er afgørende for genregulering. Regulatoriske proteiner, der genkender specifikke sekvenser, er vigtige for genreguleringen. Definering af funktionelle bindingssteder for sådanne proteiner er et udfordrende biologisk problem. En iterativ tilgang til identifikation af et bindingssted for et RNA-bindende protein er beskrevet her og gælder for alle RNA-bindende proteiner.

Abstract

Gen-forordningen spiller en vigtig rolle i alle celler. Transkriptional, post-transkriptional (eller RNA Processing), translationelle og post-translationelle trin bruges til at regulere specifikke gener. Sekvens specifikke nukleinsyre bindende proteiner målretter mod specifikke sekvenser for at styre det fysiske eller tidsmæssige genekspression. Bindings stederne i nukleinsyrer er typisk karakteriseret ved mutationsanalyse. Men, talrige proteiner af interesse har ingen kendt bindingssted for en sådan karakterisering. Her beskriver vi en tilgang til at identificere hidtil ukendte bindingssteder for RNA-bindende proteiner. Det involverer iterativ udvælgelse og forstærkning af sekvenser, der starter med en randomiseret sekvens pulje. Efter flere runder af disse trin-transskription, binding, og forstærkning-de berigede sekvenser er sekvenseret for at identificere en foretrukken bindingssted (r). En vellykket fremgangsmåde overvåges ved hjælp af in vitro-bindende assays. Efterfølgende kan in vitro og in vivo funktionelle analyser anvendes til at vurdere den biologiske relevans af de valgte sekvenser. Denne fremgangsmåde muliggør identifikation og karakterisering af et tidligere ukendt bindingssted (r) for ethvert RNA-bindende protein, for hvilket der findes en analyse til at adskille proteinbundne og ubundne RNAs.

Introduction

I cellebiologi spiller genforordningen en central rolle. Ved et eller flere trin langs genekspressions vejen har gener potentialet til at blive reguleret. Disse trin omfatter transskription (indledning, forlængelse og opsigelse) samt splejning, polyadenylering eller 3 ‘ ende dannelse, RNA eksport, mRNA oversættelse, og forfald/lokalisering af primære udskrifter. På disse trin moduerer nukleinsyre bindende proteiner genreguleringen. Identifikation af bindingssteder for sådanne proteiner er et vigtigt aspekt af studiet af genkontrol. Mutational analyse og phylogenetiske sekvens sammenligning er blevet brugt til at opdage lovgivningsmæssige sekvenser eller proteinbindende steder i nukleinsyrer, såsom initiativtagere, Splice sites, polyadenylation elementer, og translationelle signaler^{1, 2 , 3 , 4}.

Præ-mRNA splejsning er et integreret trin under genekspression og regulering. Størstedelen af pattedyrs gener, herunder hos mennesker, har introner. En stor del af disse udskrifter er alternativt spliced, der producerer flere mRNA og protein isoformer fra samme gen eller primær afskrift. Disse isoformer har celle specifikke og udviklingsmæssige roller i cellebiologi. 5 ‘ splejsnings sted, filial-punktet, og polypyrimidinkanalen/3 ‘ Splice site er kritiske spyddet signaler, der er underlagt regulering. I negativ regulering undertrykkes et ellers stærkt Splice-websted, hvorimod der i positiv regulering er aktiveret et ellers svagt Splice-websted. En kombination af disse hændelser giver en overflod af funktionelt adskilte isoformer. RNA-bindende proteiner spiller nøgleroller i disse alternative splejsning-events.

Talrige proteiner er kendt, hvis bindende site (s) eller RNA mål mangler at blive identificeret^5,6. Det er ofte en kompleks proces at kæde regulerings proteiner sammen med deres efterfølgende biologiske mål eller sekvenser. For sådanne proteiner er identifikation af deres målrna eller bindingssted et vigtigt skridt i fastlæggelsen af deres biologiske funktioner. Når en binding site er identificeret, kan det yderligere karakteriseret ved hjælp af standard molekylære og biokemiske analyser.

Den fremgangsmåde, der er beskrevet her, har to fordele. For det første kan den identificere et hidtil ukendt bindingssted for et protein af interesse. For det andet, en ekstra fordel ved denne fremgangsmåde er, at det samtidig tillader mætning mutagenese, som ellers ville være arbejdskrævende at opnå sammenlignelige oplysninger om sekvens krav inden for bindingsstedet. Således, det giver en hurtigere, lettere og billigere værktøj til at identificere proteinbindende sites i RNA. Oprindeligt blev denne tilgang (SELEX eller systematisk udvikling af ligands ved eksponentiel berigelse) anvendt til at karakterisere bindingsstedet for bakteriophage T4 DNA Polymerase (gen 43 protein), som overlapper med ribosom bindingsstedet i sin egen mRNA. Bindingsstedet indeholder en 8-base loop sekvens, der repræsenterer 65.536 randomiserede varianter til analyse⁷. For det andet blev tilgangen også selvstændigt anvendt til at påvise, at specifikke bindingssteder eller aptamere til forskellige farvestoffer kan vælges fra en pulje på ca. 10¹³ sekvenser⁸. Faktisk er denne fremgangsmåde blevet bredt anvendt i mange forskellige sammenhænge til at identificere aptamers (RNA eller DNA-sekvenser) for binding talrige ligands, såsom proteiner, små molekyler, og celler, og for katalyse⁹. Som et eksempel, en aptamer kan diskriminere mellem to xanthin derivater, koffein og theophyllin, som adskiller sig ved tilstedeværelsen af en methylgruppe i koffein¹⁰. Vi har flittigt brugt denne tilgang (SELEX eller iterativ udvælgelse-forstærkning) til at studere, hvordan RNA-bindende proteiner fungerer i splejsning eller splejning regel¹¹, som vil være grundlaget for diskussionen nedenfor.

Det tilfældige bibliotek: vi brugte et tilfældigt bibliotek med 31 nukleotider. Længden for det tilfældige bibliotek var løst baseret på idéen om, at den generelle splejsning Factor U2AF⁶⁵ binder sig til en sekvens mellem gren punkts sekvensen og 3 ‘ Splice-webstedet. I gennemsnit er afstanden mellem disse splejsning signaler i metazoans i intervallet 20 til 40 nucleotides. En anden protein sex-dødelig var kendt for at binde sig til en dårligt karakteriseret regulerende sekvens nær 3 ‘ Splice site af sit mål præ-mRNA, Transformer. Således valgte vi en tilfældig region med 31 nukleotider, flankeret af primer bindingssteder med restriktionsenzym sites for at tillade PCR forstærkning og fastgørelse af T7 RNA polymerase promotoren til in vitro transkription. Den teoretiske Biblioteks størrelse eller kompleksitet var 4³¹ eller ca. 10¹⁸. Vi brugte en lille brøkdel af dette bibliotek til at forberede vores tilfældige RNA-pulje (~ 10¹²-10¹⁵) til de eksperimenter, der er beskrevet nedenfor.

Protocol

Bemærk: figur 1 indeholder en oversigt over de vigtigste trin i processen for iterativ udvælgelse-amplifikation (SELEX). 1. generering af en tilfældig biblioteksskabelon Syntetisere Forward primer 5 ‘- Gtaatacgactcactatagggtgatcagattctgatcca-3 ‘ og den omvendte primer 5 ‘-GcgacGgatccaagcttca-3 ‘ ved kemisk syntese på en DNA-synthesizer.Bemærk: primere og Random Library kan syntetiseres kommercielt. Syntetisere en tilfældig…

Representative Results

Følgende observationer viser en vellykket udvælgelse-amplifikation (SELEX). For det første analyserede vi pulje 0 og de valgte sekvenser for binding til det protein, der blev brugt til den iterativ markerings forstærknings metode. Figur 2 viser, at det pattedyrs polypyrimidinbindende protein (PTB) viser knap detekterbar binding til pulje 0-sekvensen, men høj affinitet for den valgte sekvens pulje. Der var næppe detekterbar binding til pulje 0, når vi b…

Discussion

Nukleinsyre bindende proteiner er vigtige regulatorer af dyre-og plante udvikling. Et centralt krav til SELEX-proceduren er udvikling af en analyse, der kan anvendes til at adskille proteinbundne og ubundne RNA-fraktioner. I princippet kan denne analyse være en in vitro-bindings test, såsom filter bindende assay, gel Mobility Shift-analysen eller en matrix bindings analyse¹⁹ for rekombinante proteiner, rensede proteiner eller protein komplekser. Analysen kan også være en enzymatisk analyse, hv…

Materials

Gel Electrophoresis equipment	Standard	Standard
Glass Plates	Standard	Standard
Nitrocellulose	Millipore	HAWP
Nitrocellulose	Schleicher & Schuell	PROTRAN
polyacrylamide gel solutions	Standard	Standard
Proteinase K	NEB	P8107S
Recombinant PTB	Laboratory Preparation	Not applicable
Reverse Transcriptase	NEB	M0277S
Vacuum manifold	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold	Millipore	XX2702552	1225 Sampling Vacuum Manifold
X-ray films	Standard	Standard