تشكيل كربونات الكالسيوم في وجود المضافات البوليمرية الحيوية
Summary
نحن نصف بروتوكول لهطول الأمطار وتوصيف بلورات كربونات الكالسيوم التي تشكل في وجود البوليمرات الحيوية.
Abstract
التمعدن الحيوي هو تشكيل المعادن في وجود جزيئات عضوية، وغالبا ما ترتبط مع الأدوار الوظيفية و / أو الهيكلية في الكائنات الحية. وهي عملية معقدة، وبالتالي مطلوب نظام بسيط، في المختبر، لفهم تأثير الجزيئات المعزولة على عملية التمعدن الحيوي. في كثير من الحالات، يتم توجيه المعادن الحيوية بواسطة البوليمرات الحيوية في المصفوفة خارج الخلية. من أجل تقييم تأثير البوليمرات الحيوية المعزولة على مورفولوجيا وهيكل الكالسيت في المختبر، استخدمنا طريقة انتشار البخار لهطول الأمطار من كربونات الكالسيوم، المسح المجهري الإلكترون ورامان الجزئي للتوصيف، والأشعة فوق البنفسجية المرئية (الأشعة فوق البنفسجية / فيس) امتصاص لقياس كمية البوليمر الحيوي في البلورات. في هذه الطريقة، نقوم بتعريض البوليمرات الحيوية المعزولة، المذابة في محلول كلوريد الكالسيوم، إلى الأمونيا الغازية وثاني أكسيد الكربون التي تنشأ من تحلل كربونات الأمونيوم الصلبة. في ظل الظروف التي يتم فيها الوصول إلى منتج الذوبان من كربونات الكالسيوم، يتم تشكيل كربونات الكالسيوم والبلورات. كربونات الكالسيوم لديها polymorphs مختلفة تختلف في استقرارها الدينامي الحراري: كربونات الكالسيوم غير متبلور، vaterite، أراغونيت، والكالسيت. في غياب البوليمرات الحيوية ، في ظل ظروف نظيفة ، كربونات الكالسيوم موجودة في الغالب في شكل الكالسيت ، وهو أكثر متعدد الأشكال المستقرة حراريا من كربونات الكالسيوم. هذا الأسلوب يدرس تأثير المضافات البوليمرية الحيوية على مورفولوجيا وهيكل بلورات كربونات الكالسيوم. هنا، ونحن نعرض البروتوكول من خلال دراسة بروتين بكتيري خارج الخلية، تابا، على تشكيل بلورات كربونات الكالسيوم. وعلى وجه التحديد، نركز على الإعداد التجريبي، وأساليب التوصيف، مثل الفحص المجهري البصري والإلكترون وكذلك التحليل الطيفي لرامان.
Introduction
التمعدن الحيوي هو تشكيل المعادن في وجود جزيئات عضوية، وغالبا ما ترتبط مع الأدوار الوظيفية و / أو الهيكلية في الكائنات الحية. قد يكون التمعدن الحيوي داخل الخلايا، كما هو الحالفي تشكيل المغنطيسية داخل البكتيريا المغناطيسية 1، أو خارج الخلية، كما هو الحال في تشكيل كربونات الكالسيوم في قنفذ البحر المسامير2،من هيدروكسيباتيت التي ترتبط مع الكولاجين في العظام3 والمينا التي ترتبط مع amelogenin في الأسنان4. التمعدن الحيوي هو عملية معقدة تعتمد على العديد من المعلمات في الكائن الحي. ولذلك، من أجل تبسيط النظام قيد الدراسة، من الضروري تقييم أثر المكونات المنفصلة على العملية. في كثير من الحالات، يتم التمعدن الحيوي عن طريق وجود البوليمرات الحيوية خارج الخلية. الغرض من الطريقة المعروضة هنا هي كما يلي: (1) لتشكيل بلورات كربونات الكالسيوم في وجود البوليمرات الحيوية المعزولة في المختبر، وذلك باستخدام طريقة نشر البخار. (2) دراسة تأثير البوليمرات الحيوية على مورفولوجيا وهيكل كربونات الكالسيوم.
وتستخدم ثلاث طرق رئيسية للتعجيل كربونات الكالسيوم في المختبر في وجود المضافات العضوية5،6. الطريقة الأولى، والتي سوف نشير إلى طريقة الحل، ويستند على خلط ملح قابل للذوبانمن الكالسيوم (على سبيل المثال، CaCl 2) مع ملح قابل للذوبان من كربونات (على سبيل المثال، كربونات الصوديوم). يمكن إجراء عملية الخلط بعدة طرق: داخل مفاعل مع ثلاث خلايا مفصولة بأغشية مسامية7. هنا، كل من الخلايا الخارجية يحتوي على ملح قابل للذوبان والخلية المركزية يحتوي على حل مع المضافة ليتم اختبارها. الكالسيوم والكربونات تنتشر من الخارج إلى الخلية الوسطى، مما يؤدي إلى هطول الأمطار من كربونات الكالسيوم أقل قابلية للذوبان عندما تتجاوز تركيزات الكالسيوم وكربونات المنتج الذوبان، Ksp = [Ca2+] [CO3 2-]. طريقة خلط إضافية هي إجراء طائرة مزدوجة8. في هذه الطريقة، يتم حقن كل ملح قابل للذوبان من حقنة منفصلة إلى حل أثار تحتوي على المضافة، حيث يعجل كربونات الكالسيوم. هنا، يتم التحكم في الحقن وبالتالي معدل الخلط بشكل جيد، على النقيض من الطريقة السابقة حيث يتم التحكم في الخلط عن طريق الانتشار.
الطريقة الثانية المستخدمة لبلورة كاكو3 هي طريقة كيتانو9. ويستند هذا الأسلوب على توازن كربونات / كربونات الهيدروجين (2HCO3– (AQ) + Ca2+(AQ) 
CaCO3 (ق) + CO 2(ز) + H2O (l)). هنا، يتم فقاعات CO2 في حل يحتوي على كاكو3 في شكل صلب، وتحويل التوازن إلى اليسار وبالتالي حل كربونات الكالسيوم. يتم تصفية كربونات الكالسيوم غير المذابة وتضاف الإضافات المطلوبة إلى الحل الغني بالبيكربونات. ثم يسمح CO2 لتبخر، وبالتالي تحويل رد الفعل إلى اليمين، وتشكيل كربونات الكالسيوم في وجود الإضافات.
الطريقة الثالثة لتبلور كربونات الكالسيوم، والتي سوف نصفهنا، هو طريقة انتشار بخار10. في هذه المجموعة، يتم وضع المضافة العضوية، المذابة في محلول كلوريد الكالسيوم، في غرفة مغلقة بالقرب من كربونات الأمونيوم في شكل مسحوق. وعندما يتحلل مسحوق كربونات الأمونيوم إلى ثاني أكسيد الكربون والأمونيا، فإنها تنتشر فيالحل الذي يحتوي على أيونات الكالسيوم (مثل CaCl 2)، ويُترسب كربونات الكالسيوم (انظر الشكل 1 للاطلاع على التوضيح). يمكن أن تنمو بلورات كربونات الكالسيوم عن طريق هطول الأمطار البطيء أو عن طريق هطول الأمطار السريع. لطول الأمطار البطيء، يتم وضع حل يحتوي على المضافة في محلول CaCl2 في المجفف بجوار مسحوق كربونات الأمونيوم. في هطول الأمطار السريع، الموصوفة في الطول في البروتوكول، يتم وضع كل من الحل المضافة وكربونات الأمونيوم أقرب معا في لوحة متعددة الآبار. وسوف تنتج طريقة هطول الأمطار بطيئة عدد أقل من مراكز النويات وبلورات أكبر، وسوف يؤدي هطول الأمطار السريع إلى المزيد من مراكز النويات والبلورات الصغيرة.
وتختلف الأساليب الموصوفة أعلاه في تعقيدها التقني، وفي مستوى المراقبة، وفي معدل عملية هطول الأمطار. تتطلب طريقة الخلط إعداد خاص6 لكل من الطائرة المزدوجة ونظام الخلايا الثلاث. في طريقة الخلط، وجود أيونات مضادة أخرى قابلة للذوبان (على سبيل المثال، Na+، Cl–)6 أمر لا مفر منه، في حين أن في طريقة كيتانو، والكالسيوم و (بي) كربونات هي الأيونات الوحيدة في الحل، وأنه لا ينطوي على وجود إضافية الأيونات المضادة (على سبيل المثال، Na+، Cl–). وعلاوة على ذلك، فإن طريقة الخلط تتطلب كميات كبيرة نسبيا، وبالتالي فهي ليست مناسبة للعمل مع البوليمرات الحيوية باهظة الثمن. ميزة طائرة مزدوجة هو أنه من الممكن للسيطرة على معدل حقن الحل وأنه هو عملية سريعة بالمقارنة مع أساليب أخرى.
ميزة طريقة كيتانو وطريقة انتشار البخار هو أن يتم التحكم في تشكيل كربونات الكالسيوم عن طريق نشر CO2 إلى / خارج محلول CaCl2، مما يسمح للتحقيق أبطأ عمليات النويات وهطول الأمطار 11 , 12.وعلاوة على ذلك، تشكيل كربونات الكالسيوم عن طريق نشر ثاني أكسيد الكربون قد تشبه عمليات التكلس في الجسم الحي13،14،15. في هذه الطريقة، يتم تشكيل بلورات محددة جيدا ومنفصلة16. وأخيرا، يمكن اختبار تأثير البوليمرات الحيوية واحدة أو متعددة على تشكيل كربونات الكالسيوم. وهذا يتيح دراسة منهجية لتأثير سلسلة من التركيزات المضافة على تشكيل كربونات الكالسيوم، فضلا عن دراسة خليط من البوليمرات الحيوية – كل ذلك يتم بطريقة خاضعة للرقابة. هذه الطريقة مناسبة للاستخدام مع مجموعة كبيرة من التركيزات وكميات من المواد المضافة. الحد الأدنى من الحجم المستخدم هو ما يقرب من 50 درجة مئوية، وبالتالي فإن هذه الطريقة مفيدة عندما يكون هناك كمية محدودة من البوليمرات الحيوية المتاحة. يعتمد الحجم الأقصى على إمكانية الوصول إلى لوحة بئر أكبر، أو المجفف الذي يتم إدخال اللوحة أو الكأس التي تحتوي على CaCl 2. وقد تم تحسين الطريقة الموضحة أدناه للعمل في لوحة 96 جيدا مع البوليمر الحيوي اختار أن يكون البروتين تابا17.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الموصوفة هنا تهدف إلى تشكيل بلورات كربونات الكالسيوم في وجود المضافات العضوية وتقييم تأثير البوليمرات الحيوية العضوية على مورفولوجيا وهيكل بلورات كربونات الكالسيوم في المختبر. ويستند الأسلوب على مقارنة بلورات شكلت في وجود المضافات العضوية لبلورات الكالسيت شكلت في تجربة التحكم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفان أن يشكرا البروفيسور ليا آدي، والبروفيسور جوناثان إيريز، والدكتور يائيل بوليتي على المناقشات المثمرة. وقد تم دعم هذا البحث من قبل مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF)، منحة 1150/14.
Materials
| Acetic acid | Gadot | 64-19-7 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 506-87-6 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 10035-04-8 | |
| Ethanol Absolute | Gadot | 64-17-5 | |
| Micro-Raman | Renishaw | inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 90i model | |
| Nis elements Br software | Nikon | For microscope imaging | |
| Scanning Electron Microscope | ThermoFisher Scientific | FEI Sirion microscope | |
| Spectrophotometer | JASCO | V-670 model | |
| Sputter coater | Polaron | SC7640 model |
References
- Blakemore, R. Magnetotactic bacteria. Science. 190 (4212), 377-379 (1975).
- Politi, Y., Arad, T., Klein, E., Weiner, S., Addadi, L. Sea Urchin Spine Calcite Forms via a Transient Amorphous Calcium Carbonate Phase. Science. 306 (5699), 1161-1164 (2004).
- Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A. J. M., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. Journal of Structural Biology. 183 (2), 258-269 (2013).
- Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R. K. . Biomineralization: from nature to application. 12, (2008).
- Nielsen, M. H., Lee, J. R. I., De Yoreo, J. J. . Methods in Enzymology. 532, 209-224 (2013).
- Page, M. G., Cölfen, H. Improved Control of CaCO3 Precipitation by Direct Carbon Dioxide Diffusion: Application in Mesocrystal Assembly. Crystal Growth & Design. 6 (8), 1915-1920 (2006).
- Wang, H., Huang, W., Han, Y. Diffusion-reaction compromise the polymorphs of precipitated calcium carbonate. Particuology. 11 (3), 301-308 (2013).
- Sedlák, M., Antonietti, M., Cölfen, H. Synthesis of a new class of double-hydrophilic block copolymers with calcium binding capacity as builders and for biomimetic structure control of minerals. Macromolecular Chemistry and Physics. 199 (2), 247-254 (1998).
- Kitano, Y., Park, K., Hood, D. W. Pure aragonite synthesis. Journal of Geophysical Research. 67 (12), 4873-4874 (1962).
- Politi, Y., Mahamid, J., Goldberg, H., Weiner, S., Addadi, L. Asprich mollusk shell protein: in vitro experiments aimed at elucidating function in CaCO3 crystallization. CrystEngComm. 9 (12), 1171-1177 (2007).
- Gehrke, N., Cölfen, H., Pinna, N., Antonietti, M., Nassif, N. Superstructures of Calcium Carbonate Crystals by Oriented Attachment. Crystal Growth & Design. 5 (4), 1317-1319 (2005).
- Rudloff, J., et al. Double-Hydrophilic Block Copolymers with Monophosphate Ester Moieties as Crystal Growth Modifiers of CaCO3. Macromolecular Chemistry and Physics. 203 (4), 627-635 (2002).
- Boquet, E., Boronat, A., Ramos-Cormenzana, A. Production of Calcite (Calcium Carbonate) Crystals by Soil Bacteria is a General Phenomenon. Nature. 246, 527 (1973).
- Cohen, A. L., McConnaughey, T. A. Geochemical Perspectives on Coral Mineralization. Reviews in Mineralogy and Geochemistry. 54 (1), 151-187 (2003).
- Erez, J. Vital effect on stable-isotope composition seen in foraminifera and coral skeletons. Nature. 273, 199 (1978).
- Azulay, D. N., et al. Biopolymers from a Bacterial Extracellular Matrix Affect the Morphology and Structure of Calcium Carbonate Crystals. Crystal Growth & Design. 18 (9), 5582-5591 (2018).
- Abbasi, R., et al. The Bacterial Extracellular Matrix Protein TapA Is a Two-Domain Partially Disordered Protein. ChemBioChem. , (2018).
- Gauldie, R. W., Sharma, S. K., Volk, E. Micro-raman spectral study of vaterite and aragonite otoliths of the coho salmon, Oncorhynchus kisutch. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 118 (3), 753-757 (1997).
- Gasteiger, E., et al. . The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Gunasekaran, S., Anbalagan, G., Pandi, S. Raman and infrared spectra of carbonates of calcite structure. Journal of Raman Spectroscopy. 37 (9), 892-899 (2006).
- Trushina, D. B., Bukreeva, T. V., Kovalchuk, M. V., Antipina, M. N. CaCO3 vaterite microparticles for biomedical and personal care applications. Materials Science and Engineering: C. 45, 644-658 (2014).
- Weiss, I. M., Tuross, N., Addadi, L., Weiner, S. Mollusc larval shell formation: amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite. Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 478-491 (2002).
- Yamamoto, Y., Nishimura, T., Saito, T., Kato, T. CaCO3/chitin-whisker hybrids: formation of CaCO3 crystals in chitin-based liquid-crystalline suspension. Polymer Journal. 42, 583 (2010).
- Magnabosco, G., et al. Insights on the interaction of calcein with calcium carbonate and its implications in biomineralization studies. CrystEngComm. 20 (30), 4221-4224 (2018).
