Calciumcarbonatbildung in Gegenwart biopolymerer Additive

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll zur Ausfällung und Charakterisierung von Calciumcarbonatkristallen, die sich in Gegenwart von Biopolymeren bilden.

Abstract

Biomineralisierung ist die Bildung von Mineralien in Gegenwart von organischen Molekülen, die oft mit funktionellen und/oder strukturellen Rollen in lebenden Organismen zusammenhängen. Es ist ein komplexer Prozess und daher ein einfaches, in vitro, System erforderlich, um die Wirkung isolierter Moleküle auf den Biomineralisierungsprozess zu verstehen. In vielen Fällen wird die Biomineralisierung durch Biopolymere in der extrazellulären Matrix gesteuert. Um die Wirkung isolierter Biopolymere auf die Morphologie und Struktur von Calcit in vitro zu bewerten, haben wir das Dampfdiffusionsverfahren zur Ausfällung von Calciumcarbonat, Rasterelektronenmikroskopie und Mikro Raman für die Charakterisierung, ultraviolett-sichtbare (UV/Vis) Absorption zur Messung der Menge eines Biopolymers in den Kristallen. Bei diesem Verfahren setzen wir die isolierten Biopolymere, die in einer Calciumchloridlösung gelöst werden, gasförmigem Ammoniak und Kohlendioxid aus, die aus der Zersetzung von festem Ammoniumcarbonat stammen. Unter den Bedingungen, unter denen das Löslichkeitsprodukt von Calciumcarbonat erreicht wird, bilden sich Calciumcarbonatausscheidungen und Kristalle. Calciumcarbonat hat verschiedene Polymorphe, die sich in ihrer thermodynamischen Stabilität unterscheiden: amorphes Calciumcarbonat, Vaterit, Aragonit und Calcit. In Ermangelung von Biopolymeren ist Calciumcarbonat unter sauberen Bedingungen meist in der Calcitform vorhanden, die das thermodynamisch stabileste Polymorph von Calciumcarbonat ist. Diese Methode untersucht die Wirkung der biopolymeren Additive auf die Morphologie und Struktur von Calciumcarbonatkristallen. Hier zeigen wir das Protokoll durch die Untersuchung eines extrazellulären bakteriellen Proteins, TapA, über die Bildung von Calciumcarbonatkristallen. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die experimentelleN Einrichtung und Charakterisierungsmethoden, wie optische und Elektronenmikroskopie sowie Raman-Spektroskopie.

Introduction

Biomineralisierung ist die Bildung von Mineralien in Gegenwart von organischen Molekülen, die oft mit funktionellen und/oder strukturellen Rollen in lebenden Organismen zusammenhängen. Die Biomineralisierung kann intrazellulär sein, wie bei der Bildung von Magnetit in magnetotaktischen Bakterien¹, oder extrazellulär, wie bei der Bildung von Calciumcarbonat in Seeigelspitzen², von Hydroxyapatit, das mit Kollagen in Knochen³ und von Zahnschmelz, der mit Amelogenin in den Zähnen assoziiert ist⁴. Biomineralisierung ist ein komplexer Prozess, der von vielen Parametern im lebenden Organismus abhängt. Um das untersuchte System zu vereinfachen, ist es daher notwendig, die Auswirkungen separater Komponenten auf den Prozess zu bewerten. In vielen Fällen wird die Biomineralisierung durch das Vorhandensein extrazellulärer Biopolymere induziert. Der Zweck der hier vorgestellten Methode ist wie folgt: (1) Calciumcarbonatkristalle in Gegenwart von isolierten Biopolymeren in vitro unter Verwendung einer Dampfdiffusionsmethode zu bilden. (2) Untersuchung der Wirkung der Biopolymere auf die Morphologie und Struktur von Calciumcarbonat.

Es werden drei Hauptmethoden zur Ausscheidung von Calciumcarbonat in vitro in Gegenwart organischer Zusatzstoffe verwendet^5,6. Die erste Methode, die wir als Lösungsmethode bezeichnen werden, basiert auf dem Mischen eines löslichen Calciumsalzes (z.B. CaCl₂) mit einem löslichen Salz aus Carbonat (z. B. Natriumcarbonat). Der Mischprozess kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden: in einem Reaktor mit drei Zellen, die durch poröse Membranen getrennt sind⁷. Hier bei jeder der äußeren Zellen befindet sich ein lösliches Salz und die Zentralzelle enthält eine Lösung mit dem zu prüfenden Additiv. Calcium und Karbonat diffundieren von der äußeren in die mittlere Zelle, was zur Ausfällung des weniger löslichen Calciumcarbonats führt, wenn die Konzentrationen von Kalzium und Karbonat ihr Löslichkeitsprodukt überschreiten, K_sp = [Ca²⁺][CO₃ ^2-]. Eine zusätzliche Mischmethode ist das Doppelstrahlverfahren⁸. Bei diesem Verfahren wird jedes lösliche Salz aus einer separaten Spritze in eine Rührlösung injiziert, die den Zusatzstoff enthält, wo Kalziumkarbonat ausfällt. Hierbei ist die Injektion und damit die Mischrate gut kontrolliert, im Gegensatz zur bisherigen Methode, bei der das Mischen durch Diffusion gesteuert wird.

Die zweite Methode, die verwendet wird, um CaCO₃ zu kristallisieren, ist die Kitano-Methode⁹. Diese Methode basiert auf dem Carbonat/Wasserstoffcarbonat-Gleichgewicht (2HCO₃^– _(aq) + Ca²⁺_(aq) CaCO 3_(s) + CO 2_(g) + H 2_{O (l)}). Hier wird CO2 in eine Lösung geblasen, die CaCO₃ in fester Form enthält, das Gleichgewicht nach links verschiebt und somit das Calciumcarbonat auflöst. Das ungelöste Calciumcarbonat wird gefiltert und die gewünschten Additive in die bicarbonatreiche Lösung aufgenommen. CO₂ darf dann verdampfen, wodurch die Reaktion nach rechts verschoben wird, wodurch Kalziumkarbonat in Gegenwart der Additive gebildet wird.

Die dritte Methode der Calciumcarbonatkristallisation, die wir hier beschreiben werden, ist die Dampfdiffusionsmethode¹⁰. In diesem Aufbau wird der organische Zusatzstoff, gelöst in einer Lösung von Calciumchlorid, in einer geschlossenen Kammer in der Nähe von Ammoniumcarbonat in Pulverform gelegt. Wenn Ammoniumcarbonatpulver in Kohlendioxid und Ammoniak zerfällt, diffundieren sie in die Lösung, die Calciumionen enthält (z. B. CaCl₂), und Calciumcarbonat wird ausgefällt (abbildung 1 siehe Abbildung). Die Calciumcarbonatkristalle können durch langsamen Niederschlag oder durch schnelle Niederschläge wachsen. Bei gleichzeitigem Niederschlag wird eine Lösung, die das Additiv in CaCl 2-Lösung enthält, in einen Trockentrockner neben dem Ammoniumcarbonatpulver gelegt. Bei der im Protokoll beschriebenen schnellen Ausfällung werden sowohl die Additivlösung als auch das Ammoniumcarbonat in einer Mehrbrunnenplatte näher beieinander platziert. Die Methode der langsamen Ausfällung wird weniger Keimzentren und größere Kristalle produzieren, und die schnelle Ausfällung wird zu mehr Kernzentren und kleineren Kristallen führen.

Die oben beschriebenen Methoden unterscheiden sich in ihrer technischen Komplexität, in der Kontrollebene und in der Rate des Fällungsprozesses. Die Mischmethode erfordert eine spezielle Einrichtung⁶ sowohl für den Doppelstrahl als auch für das Dreizellsystem. Bei der Mischmethode ist das Vorhandensein anderer löslicher Gegenionen (z. B. Na⁺, Cl^–)⁶ unvermeidlich, während bei der Kitano-Methode Kalzium und (Bi)carbonat die einzigen Ionen in Lösung sind und es nicht das Vorhandensein zusätzlicher Gegenionen (z.B. Na⁺, Cl^–). Darüber hinaus benötigt das Mischverfahren relativ große Volumina und eignet sich daher nicht für die Arbeit mit teuren Biopolymeren. Der Vorteil des Doppelstrahls ist, dass es möglich ist, die Rate der Lösungsinjektion zu kontrollieren und dass es ein schneller Prozess im Vergleich zu anderen Methoden ist.

Der Vorteil der Kitano-Methode und der Dampfdiffusionsmethode besteht darin, dass die Bildung von Calciumcarbonat durch Diffusion von CO2 in/aus einer CaCl 2-Lösung gesteuert wird, wodurch langsamere Keim- und Niederschlagsprozesse untersucht werden können. ^{11 , 12}. Darüber hinaus kann die Calciumcarbonatbildung durch Diffusion von_CO2 Verkalkungsprozessen in vivo^13,14,15ähneln. Bei dieser Methode werden gut definierte und getrennte Kristalle^{gebildet 16}. Schließlich kann die Wirkung einzelner oder mehrerer Biopolymere auf die Kalziumkarbonatbildung getestet werden. Dies ermöglicht eine systematische Untersuchung der Wirkung einer Reihe von Additivkonzentrationen auf die Calciumcarbonatbildung sowie eine Untersuchung von Mischungen von Biopolymeren – die alle kontrolliert durchgeführt werden. Dieses Verfahren eignet sich für den Einsatz mit einer Vielzahl von Konzentrationen und Mengen von Additiven. Das minimale Volumen beträgt ca. 50 l und daher ist dieses Verfahren vorteilhaft, wenn eine begrenzte Menge der verfügbaren Biopolymere vorhanden ist. Das maximale Volumen hängt von der Zugänglichkeit einer größeren Wellplatte oder des Trockenmittels ab, in das die Platte oder der Becher, der CaCl₂ enthält, eingesetzt werden soll. Das unten beschriebene Verfahren wurde für die Arbeit in einer 96-Well-Platte mit einem Biopolymer optimiert, das als Protein TapA¹⁷ausgewählt wurde.

Protocol

1. Calciumcarbonatkristallisation Steuerungsvorbereitung und -optimierung Bereiten Sie saubere Glasstücke vor. Verwenden Sie das gleiche Reinigungsverfahren, um die Glaswaren zu reinigen. Verwenden Sie einen Diamantstift, um Teile eines Glasmikroskopschlittens zu schneiden, so dass sie in einen Brunnen einer 96-Well-Platte passen.HINWEIS: 5 mm x 5 mm Stücke sollten weitgehend passen. Legen Sie die Glasstücke in einen Becher mit dreifach destilliertem Wasser (…

Representative Results

Ein Schaltplan der Versuchseinrichtung ist in Abbildung 1dargestellt. Kurz gesagt, wird die Diffusionsmethode verwendet, um Calciumcarbonatkristalle in 96-Well-Platten zu bilden und die Wirkung von Biopolymeren auf die Morphologie und Struktur der Calciumcarbonatkristalle zu testen. In diesen Experimenten wird Ammoniumcarbonat inAmmoniak und CO2 zerlegt, die in Calciumcarbonatlösungen diffundieren, was zur Bildung von Calciumcarbonatkristallen führt (Abbildu…

Discussion

Das hier beschriebene Verfahren zielt darauf ab, Kalziumkarbonatkristalle in Gegenwart organischer Additive zu bilden und die Wirkung organischer Biopolymere auf die Morphologie und Struktur von Calciumcarbonatkristallen in vitro zu bewerten. Das Verfahren basiert auf dem Vergleich der Kristalle, die in Gegenwart der organischen Additive gebildet werden, mit den calcitkristallen, die im Kontrollexperiment gebildet wurden. Wir haben gezeigt, wie man die Diffusionsmethode zur Bildung der Calciumcarbonatkristalle verwendet,…

Materials

Acetic acid	Gadot	64-19-7
Ammonium carbonate	Sigma-Aldrich	506-87-6
Calcium chloride dihydrate	Merck KGaA	10035-04-8
Ethanol Absolute	Gadot	64-17-5
Micro-Raman	Renishaw		inVia Reflex spectrometer coupled with an upright Leica optical microscope
Microscope	Nikon		Eclipse 90i model
Nis elements Br software	Nikon		For microscope imaging
Scanning Electron Microscope	ThermoFisher Scientific		FEI Sirion microscope
Spectrophotometer	JASCO		V-670 model
Sputter coater	Polaron		SC7640 model