Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

כריתה של ספרות עכבר למבוגרים והתחדשות: מודל פשוט כדי לחקור ממגי בלסטאמה היווצרות הIntramembranous פיקציה

Published: July 12, 2019 doi: 10.3791/59749
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Veterinary Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, 2Department of Veterinary Integrative Biosciences, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, 3Department of Neurosurgery, University of Mississippi Medical Center

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול של מסוף העכבר למבוגרים פלקים כריתת כריתה לחקור היווצרות בלסטאמה blastema ו intramembranous להתקשות, מנותח על ידי הפלורסנט אימונוהיסטוכימיה ו רציפים ב-vivo מיקרו טומוגרפיית.

Abstract

כאן, אנו מציגים פרוטוקול של העכבר המבוגר מהטרמינל פלנקס (P3) קטיעה, המודל התהליכים פשוטה ומתחדעה של התחדשות אפימורדית, אשר כרוך היווצרות blastema ו intramembranous האוסיפיקציה שנותחו על ידי אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית ו רציפים ב-vivo מיקרו טומוגרפיה (μCT). התחדשות היונקים מוגבלת לקטיעות המעבר באזור המרוחק של הטרמינל (P3); ספרות הנככרות ברמות הגבוהות יותר אינן מצליחות להתחדש ולעבור ריפוי פיברוטי והיווצרות צלקת. תגובת ההתחדשות מתווכת על ידי היווצרות blastema שהתרבות, ואחריו התחדשות העצם דרך intramembranous אוסיפיקציה כדי לשחזר את אורך השלד הקטוע. P3 קטיעה היא מודל טרום קליני לחקור התחדשות אפימורמכולה יונקים, והוא כלי רב עוצמה לעיצוב של אסטרטגיות טיפוליות להחליף ריפוי פיברוטיק עם תגובת התחדשות מוצלחת. הפרוטוקול שלנו משתמש אימונוהיסטוכימיה הפלואורסצנטית ל 1) לזהות אוכלוסיות מוקדמות ומאוחרות של בלסטאמה, 2) מחקר revascularization בהקשר של התחדשות, ו 3) לחקור האוסיפיקציה intramembranous ללא צורך בעצם מורכב מכשירי ייצוב. אנו גם להדגים את השימוש רציפים ב vivo μCT כדי ליצור תמונות ברזולוציה גבוהה כדי לבחון שינויים מורפולוגיים לאחר קטיעה, כמו גם לכמת נפח ושינויי אורך באותה ספרה במהלך התחדשות. אנו מאמינים פרוטוקול זה מציע כלי השירות העצום כדי לחקור את התגובות שניהם התחדשות מנוונת ורקמות ביונקים.

Introduction

יונקים, כולל בני אדם ועכברים, יש את היכולת לחדש את קצות הספרות שלהם לאחר הסדר המרוחק של הטרמינל פלנקס (P3)1,2,3. בעכברים, תגובת ההתחדשות היא תלוית ברמת קטיעה; קטיעות הספרות האבותיים יותר ויותר להציג תגובת משובי בהדרגה החליש עד כשל התחדשות מלאה בקטיעות transecting ואת האבובית לתוך P3 מטריצה4,5,6 , מיכל סבן , 8. P3 התחדשות מתווכת על ידי היווצרות blastema, מוגדר כאוכלוסייה של תאים מתרבים העוברים מורפולגנזה כדי לחדש את המבנים הקטוע9. היווצרות של blastema כדי לחדש את המבנים שאבדו על ידי קטיעה, תהליך שנקרא התחדשות אפימורפית, מבדיל את תגובת התחדשות P3 ברמת רקמה מסורתית לאחר פציעה6, 10. P3 התחדשות היא מודל מתהליכים פשוטה לחקור תהליכים רגנרטיבית מורכבים כולל ריפוי הפצע11,12, עצם histolysis11,12, התחדשות העצביםההיקפית14, ו המרה בלסטאל עצם באמצעות intramembranous האוסיפיקציה15.

מחקרים קודמים באמצעות אימונוהיסטוכימיה הוכיחו כי blastema הוא הטרוגנית, נמק העצם, ארוי, ו מתרבים מאוד11,13,15,16. בעקבות קטיעה P3 המוקדמות, הבלסטמה המוקדמת קשורה בתחילה עם קרום העצם הP3 ו אנדוסטנום והוא מאופיין על ידי התפשטות חזקה ו אוסטגנזה המתהווה בסמוך למשטח העצמות15. בעקבות השפלה העצם וסגר הפצע, הטרוגנית blastema נוצר על ידי מיזוג של התאים קרום ולגנוב הקשורים, ואחריו הבידול של רכיבי בלסטאל כולל עצם באמצעות intramembranous האוסיפיקציה . חמש עשרה

תיקון עצם בתגובה לפציעה מתרחשת בדרך כלל על ידי endochondral אוסיפיקציה, כלומר באמצעות סחוס השבר הראשוני המהווה תבנית להיווצרות העצם העוקבים17,18. עצם ארוך intramembranous פיקציה, כלומר, היווצרות העצם ללא ביניים סחוס הרסניות, הוא המושרה בדרך כלל באמצעות מכשירים הסחת דעת מורכבים או קיבעון כירורגי19,20. התגובה התחדשות הספרה הוא מודל טרום קליני המציעה יתרונות על מודלים intramembranous האוסיפיקציה קונבנציונאלי: 1) זה לא דורש פגיעה חיצונית או פנימית הפוסט לעורר intramembranous האוסיפיקציה, 2) זה שבוצעו באמצעות 4 ספרות מכל בעל חיים, ובכך למקסם דגימות תוך מזעור שימוש בעלי חיים, ו 3) רציפים בvivo מיקרו טומוגרפיה (μCT) ניתוח ניתן לבצע בקלות ובמהירות.

במחקר הנוכחי, אנו מציגים את המטוס P3 קטיעה סטנדרטית כדי להשיג תגובה התחדשות חזקה ואיתנה. בנוסף, אנו מדגימים פרוטוקול ממוטב האימונוהיסטוכימיה ממוטבת באמצעות מקטעי פרפין כדי להמחיש היווצרות blastema, revascularization בהקשר של התחדשות, והמרה בלסטאל עצם באמצעות intramembranous תאבנות. אנו גם להדגים את השימוש רציפים ב-vivo μCT כדי לזהות שינויים מורפולוגיה העצם, נפח, ואורך באותה ספרה במהלך התחדשות. המטרה של פרוטוקול זה היא לחקור את היווצרות היונקים בלסטי לאחר קטיעה ולהדגים 2 טכניקות, אימונוהיסטוכימיה הפלואורסצנטית ו רציפים ב vivo μCT, לחקר התחדשות העצם intramembranous.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השימוש בעלי חיים וטכניקות היו בהתאם לנהלי ההפעלה הסטנדרטיים של טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש הוועדה של טקסס מ& M אוניברסיטת.

1. עכבר למבוגרים הגפיים האחוריות P3 קטיעה

  1. שימוש ב-8 עד 12 שבוע בדיסק CD-1 (טבלה של חומרים) באמצעות גז isofלאנה בחמצן; בתחילה הורדם ב 3% בחדר, ואחריו 2% isofלאנה שסופקו על ידי nosecone במשך הניתוח. החלת משחה אופטלמולוגית על העיניים כדי למנוע יובש תוך כדי הרדמה.
    הערה: P3 למבוגרים כריתת מחקרים מתוקננת במעבדה שלנו מבוצעים על 8 כדי 12 שבוע עכברים בן, ואת תגובת התחדשות נשמרים כל הזנים נבדק.
  2. תחת מיקרוסקופ לנתיחה 10x, לחטא את הספרות של האיבר האחוריות עם Povidone כירורגי-יוד ו 70% אתנול. לקצץ שיער הרחק מהאתר כירורגי באמצעות מיקרו מספריים. החל 1 μL של בוטטין אקטואלי באופן מקומי כדי לאשר את האתר הכירורגי.
  3. לקטוע את הקצה המרוחק של מסוף פלנקס (P3) על ספרות 2 ו 4 של הגפיים האחוריות באמצעות אזמל10 סטרילי (איור 1A). קטיעה יש לבצע בתנאים אספטי, כולל עיקור של כלי ניתוח. תחת מיקרוסקופ הניתוח, וזר בעדינות את הרגל האחוריות כדי לחשוף את משטח הספרות המדיאלי. החזיקו את האזמל בזווית מקבילה ל-fatpad כדי לבצע את הקטיעה המוצגת באיור 1B. החל 1 μL של בופיטין אקטואלי לאתר קטיעה.
    הערה: קטיעה כתות איבר הציפורן, dermis, העצם P3, והעצבים, ועצבי, אבל לא מעביר את החלל במח או את פד השומן ספרה. אם הדימום הוא נצפתה, להחיל לחץ ישיר באמצעות המוליך כותנה סטרילית עצה.
  4. המטוס הסטנדרטי P3 הכריתה מסיר כ 15% – 20% של נפח העצם P321. סריקת MicroCT (ראה להלן) ניתן לבצע כדי לאשר את אורך קטיעה הנכון.
  5. להחזיר את העכבר לכלוב נקי ולאפשר את הפצע לרפא ללא ההלבשה הפצע. נטר את העכבר במשך 3 ימים כדי להבטיח שהעכבר יחזור לפעילות נורמלית.

2. אוסף ספרות והכנה לרקמה

  1. המתת החסד העכבר באמצעות פחמן דו חמצני (CO2) בתא סגור, ואחריו פריקה צוואר הרחם.
  2. השתמש אזמל כדי לנתק את הספרה באמצע דרך קטע העצם הסמוך, פלנקס האמצעי (P2) העצם, בערך כניסת השומן השני הגחוני. העבר את הספרה (ים) ל 20 מ"ל בקבוקון במבחנה המכילה 10 mL מחדש באגירה של מוצרי האבץ לאחר מכן, a 18% פורמלדהיד פתרון (ראה טבלת חומרים). אמצעי האחסון הfixative אמור להיות לפחות 20x הנפח של הרקמה הנוכחית.
    הערה: הספרות נאספות בנקודות זמן שונות לאחר קטיעה כדי לחקור את תגובת ההתחדשות המלאה. באופן כללי, עבור היווצרות blastema מוקדם, העצם hi, הסגר הפצע את נקודות הזמן איסוף הם 4 – 8 ימים לאחר קטיעה (DPA). כדי לחקור את מוקדם אוסטגניים blastema הזמן אוסף נקודות הם 9 ו 10 DPA, ו כדי להמחיש התחדשות עצם המשך ומינרליזציה, נקודות זמן איסוף הם 14, 21, ו 28 DPA. מספרים שאינם מופרדים נאספים גם כן.
  3. תקן את הספרה 24 – 48 h בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין על שייקר.
  4. הסר את הקבע ושטוף את הספרה 2x עבור 5 דקות ב 5 מ ל של 1 x פוספט מתכלה באגירה (PBS) בטמפרטורת החדר.
  5. מקום 10 מ ל החדש decalcifier וצק אני (לראות את הטבלה של חומרים), 10% החומצה פורמית הפתרון, בבקבוקון בקבוקון בעדינות לערבב על שייקר עבור 2 h בטמפרטורת החדר. לאחר 2 h, להחליף Decalcifier וצק עם פתרון טרי ו decalcifier ספרה לילה בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין על שייקר.
  6. הסר את Decalcifier וצק אני ולשטוף את הספרה 2x עבור 5 דקות ב 5 מ ל של 1x PBS בטמפרטורת החדר.
  7. לעבד את הספרה דרך סדרת אתנול מדורגת. תהליך זה ניתן לבצע באופן ידני בבקבוקון של 20 מ"ל, באמצעות 10 מ"ל של כל נוזל אם פחות מ 40 ספרות סה.
    1. התחל עם 2 האיספרסיות טריים 70% אתנול בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין על שייקר, 1 h כל אחד, ואחריו 2 האיספרסיות טריים 95% אתנול בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין על שייקר, 1 h כל.
    2. להשלים את התייבשות הספרה עם 2 שוטף של טריים 100% אתנול בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין על שייקר, 1 h כל אחד. האחרון 100% שטיפת אתנול ניתן להשאיר בן לילה.
  8. בבקבוקון זה, החליפו את האתנול ב100% עם 10 מ ל של קסילן טרי, ומניחים את המבחנה בתוך מתקן כימי של 1.5 h בטמפרטורת החדר. חזור עם כביסה טרייה של קסילן במנוע כימי 1.5 h בטמפרטורת החדר עבור סך של 2 שטיפות.
  9. החליפו את הגרד בשעווה הנוזלית מומסת ל-68 ° c, ומניחים את המבחנה באינקובטור ב-68 ° c עבור 2 מעלות, 2 פעמים. לאחר 4 סה כ של טבילה בשעווה פרפין, להטביע את הספרה עבור המיתר פרפין.
    הערה: עיבוד ספרות עבור היסטולוגיה ניתן לבצע במעבד אוטומטי, בעקבות אותם הנחיות.
  10. ספרות מקטע בעובי של 4 – 5 יקרומטר באמצעות מיקרוטומה. מניחים דגימות מנות על שקופיות דבק, באמצעות מרחץ מים 38-41 ° c שיושלם עם פתרון דביק היסטולוגית כדי להבטיח דגימות לדבוק השקופית. מניחים שקופיות על מחמם שקופית ב37 ° c כדי להתייבש.

3. אימונוהיסטוכימיקלים מכתים של ספרות עכבר למבוגרים כדי לחקור היווצרות Blastema ו Intramembranous האוסיפיקציה

  1. החום שקופיות מנות ב 65 ° c עבור 45 דקות, ואחריו חימום ב 37 ° c עבור לא פחות מ 15 דקות כדי להבטיח דגימות לדבוק השקופית.
  2. דפפיטיס ומייבשים שקופיות 2x עם 5 דקות של שטיפת קסילן, סדרת אתנול מדורגת, ושוטף במים. מניחים שקופיות של 50-100 מ ל מכתים את הצנצנת ולשמור שקוע ב-1x טריס מלוחים באגירה עם רצף 20 (TBST).
    הערה: אין לאפשר דוגמאות לייבוש בכל תהליך הצביעת. בכל שלב של TBST, ניתן להגדיר שקופיות עד 2 שעות.
  3. . הכן תא מחולל לחות קופסת פלסטיק מכוסה עמוק בגודל 1 אינץ ' עם נייר טישו לחלח בבסיס מספיקה.
  4. הכינו את פתרון אחזור החום עבור Runx2, אוסטרקס (OSX), ומתרבים התא הגרעיני אנטיגן (PCNA). עבור לאחזור אנטיגן של osteoprogenitor סמן מוקדם, Runx2, להכין פתרון 1x של טריס-EDTA, pH 8. עבור סמן אוסטאופמחוז, OSX, להכין פתרון 1x של מאגר ציטראט, pH 6. ניתן לבצע כתמים החיסוני PCNA בכל אחד מהפתרון.
  5. להכין את הפתרון לאחזור אנטיגן פרוטאינאז K לסמן blastema CXCR422 ואת הסימון תא אנדותל פון וויללמותג פקטור 8 (vwf) על ידי הצבת 100 μl של פתרון פרוטאינאז K לכל שקופית בצינור מיקרוצנטריפוגה וחימום ל 37 ° צ' (כ 5 דקות).
    הערה: לאחזור אנטיגן עבור Runx2, OSX, ו-PCNA מבוצעת באמצעות אחזור חום, ו CXCR4 ו-vWF אנטיגן לאיחזור מבוצעת באמצעות טיפול פרוטטינואז K.
  6. עבור אחזור נוגדן המחייב חום, לטבול שקופיות בצנצנת מכתים בפתרון המתאים לאחזור אנטיגן. החום מחליק עד 95 ° c למשך 25 דקות, והקפדה על רתיחה אינה מתרחשת. להסיר צנצנת מכתים ממקור חום ולאפשר קריר בטמפרטורת החדר עבור 35 דקות.
  7. עבור השחזור אנטיגן פרוטאינאז K, להטיל שקופיות שטוח בחדר מחולל לחות, ומקום 100 μL של טרום מחומם פרוטאינאז K על השקופית. כסה את השקופיות עם רצועה קטנה של parafilm כדי להבטיח שהשקופיות לא יהיו יבשות. שקופיות דגירה עבור 12 דקות ב 37 ° c.
  8. לשטוף שקופיות 3 פעמים עבור 5 דקות ב-1x TBST בצנצנת מכתים לאחר אחזור אנטיגן.
  9. הסר שקופיות מצנצנת הצביעת והמקום לחות החדר. מקום 6 – 7 טיפות של פתרון חסימה (לוח חומרים) על השקופית, ולכסות את השקופית עם סרט פרפין טרי כדי להבטיח את השקופית לא להתייבש. מחליק שקופיות בטמפרטורה. של 1 שעות בחדר
  10. הכינו את הנוגדנים העיקריים על ידי דילול הנוגדנים לתוך מדלל נוגדן (טבלת חומרים). וורטקס כל פתרון הנוגדן העיקרי עבור 3 s. נוגדנים ראשוניים הנגזרים ממינים מארחים שונים עשויים להיות משולבים.
    הערה: מכתים אימונוהיסטוכימיה עבור Runx2 (ארנב אנטי Runx2 נוגדן, 1:250 דילול, בריכוז הסופי של 4 μg/mL) בשילוב עם PCNA (אנטי-שבטיים anti-PCNA נוגדן, 1:2000 דילול, בריכוז הסופי של 0.5 μg/mL), ו-OSX (ארנב anti-OSX נוגדן, 1:400 דילול, בריכוז הסופי של 0.125 μg/mL) בשילוב עם PCNA מוצג באיור 2. את הנוגדן נגד PCNA העכבר בשימוש במחקר זה הוא ספציפי מאוד ואינו דורש שלבים נוספים חסימת מעבר לאלה המתוארים בפרוטוקול זה. אימונוהיסטוכימיים מכתים באמצעות CXCR4 (החולדה anti-CXCR4 נוגדן, 1:500 דילול בריכוז הסופי של 2 μg/mL) ו vWF (הארנב נגד האדם השמיני והשני, 1:800 דילול, בריכוז הסופי של 41.25 μg/mL) מוצג באיור 2. נוגדנים ראשוניים היו אופטימיזציה ונבדק על ידי המעבדה שלנו תחת התנאים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלה של חומרים.
  11. הסר בזהירות את הסרט פרפין, ולרוקן בעדינות את השקופית על נייר טישו כדי להסיר פתרון חסימת עודף. מקום 100 – 200 μL של פתרון הנוגדן העיקרי על השקופית, להחליף parafilm כיסוי, ולחזור לחדר מחולל לחות. מודפה את השקפים בחדר המחולל הסגור בשעה 4 ° c.
    הערה: אל תתנו לשקופיות להתייבש תוך ריקון פתרון החסימה. שלב זה מבוצע במהירות.
  12. הסר בזהירות את ה-parafilm ורוקן בעדינות את פתרון הנוגדן הראשי מהשקופית. הצב את השקופית בצנצנת מכתיבה המכילה את המיקום החדש של ה-1X TBST. לשטוף עם חדש 1 x TBST עבור 5 דקות 3 פעמים.
  13. הכינו את הנוגדנים המשניים על ידי שילוב עם נוגדן מדלל (טבלת חומרים). מערבולת פתרון הנוגדן המשני עבור 3 s. נוגדנים משנית מצוייים שונים fluorophores נגזר ממינים שונים עשויים להיות משולבים.
    הערה: נוגדנים משניים פלואורסצנטית רגישים לאור. אלקסה Fluor 488-עז מצומדת נגד ארנב IgG (H + L) עבור Runx2, OSX, ו vWF, אלקסה Fluor 568-עז מצומדת נגד עכברוש IgG (H + L) עבור CXCR4, ו אלקסה Fluor 647-עז מצודת נגד העכבר IgG (H + L) עבור PCNA, מדולל ב 1:500 עם ריכוז סופי של 4 μg/mL , שימשו באיור 2.
  14. מקום 200 μL של פתרון נוגדן משני בשקופית, לכסות שקופית עם סרט פרפין טרי, ולחזור לחות החדר. מודקון את השקופיות בחדר המעבדה לחות סגורה עבור 45 דקות בטמפרטורת החדר. ודאו שחדר הלחות נסגר כדי להימנע מאור.
  15. הסר בזהירות את הסרט פרפין ולרוקן בעדינות את פתרון הנוגדן המשני מהשקופית. הצב את השקופית בצנצנת מכתיבה המכילה את המיקום החדש של ה-1x TBST. לשטוף עם חדש 1 x TBST עבור 5 דקות 3x. . הימנע מהאור
  16. . הכן כתם גרעיני הוסף 20 μL של DAPI (פתרון מניות DAPI הוא 5 מ"ג/mL ב H2O) כדי 200 ML של PBS 1x ו לנער במרץ כדי להבטיח הומוגניות. הישאב שקופיות עבור 5 דקות בפתרון DAPI-PBS. . הימנע מהאור
  17. שטוף שקופיות ב-dH2O במשך 3 דקות והניחו את השקופיות באוויר יבש או מייבשים בעדינות את המים מהשקופית, ומבטיחים שהדגימות לא יפריעו בזמן שאיבת האבק. . הימנע מהאור
  18. בזהירות coverslip שקופיות יבש באמצעות 100 μL של מדיום הרכבה נגד עמעום (טבלת חומרים); למנוע היווצרות בועות אוויר על השקופית במהלך השלב הגובר. אחסן את השקופיות שטוחות והרשה לגוף ההרכבה להתייבש בין לילה בטמפרטורת החדר במכולה בעלת הוכחה קלה. לאחר שהמדיום הגובר יבש, יש לאחסן שקופיות במכולה בעלת הוכחה קלה ב-4 ° צ' עד שהיא מוכנה לתצוגה.
    הערה: אם רמות לא מקובלות של בועות אוויר נוכחים לאחר ההרכבה, השקופית רכוב ניתן להציב בעדינות ב-1x PBS, את שמיכות ניתן להסיר, ופעם השקופית היא שטפה שוב במים מיובשים מחדש, ניתן לרכוב מחדש.

4. מיקרוסקופיה וניתוח תמונה

הערה: הדמיה וניתוח באמצעות מיקרוסקופ לפירוק פלורסנט ותוכנה משויכת, מצויד 3 מסנני ניאון (כדי להמחיש אלקסה Fluor 488, 568, ו 647 ננומטר), בתוספת DAPI (419 ננומטר) משמש בניסוי זה.

  1. צלם את השקופית בהגדלה של 10 x כדי ללכוד את כל אזור ה-blastema כולו.
    הערה: מתרבים גילוי נוגדן ראשוני מנצל נוגדנים משניים (אלקסה Fluor 488 ו 647) עם ספקטרום פליטה שאינו חופף כדי למזער זיהוי שגוי של תאים מתויגים. מחסור ברקע של אות פלורסנט אוטומטי ניתן לבצע באמצעות מסנן 568 ננומטר כדי להבטיח שלמות של 488 או 647 האותות. בblastema זיהוי נוגדן ראשוני מנצל נוגדנים משניים (אלקסה Fluor 488 או 568). ברקע החיסור של אות פלורסנט אוטומטית ניתן לבצע עם מסנן 568 אם באמצעות הנוגדן 488 מעלה, ו 488 מסנן הוא משתמש בנוגדן 568 מצומדת. האות פלורסנט אוטומטית קשורה בדרך כלל עם לוחית הציפורן ו אריתרופוציטים לאורך הספרה, והוא נצפתה ב 488, 568, ו 647 מסננים.

5. מסדרתי Vivo טומוגרפיה ממוחשבת (μCT)

  1. ליצור מתחדשות של ספרות של אותו חיה שנסרקו ביום אחד לפני קטיעה (לא לקטוע), 1 DPA, ו בנקודות זמן שונות עד התחדשות מלאה ב 28 DPA באמצעות המיעשה 40 (טבלת חומרים) מבוצעת בניסוי זה ומוצג ב איור 3 א.
  2. לתלבושת μCT עם אבובים כדי לאפשר זרימת חמצן לתוך ומחוץ לחדר החיות μCT, להבטיח כי החמצן זורמים מצויד מסנן פחם פעיל כדי ללכוד את isof, המלכודת.
    הערה: ודא כי לשכת החיות μCT מוקפת היטב; בדרך זו, אף בעלי חיים-חרוט אינו נדרש לאספקת isofלפני העכבר במהלך הסריקה.
  3. הכן את פרמטרי סריקת ה-Μt. הספרות נסרקות בגודל voxel של 10.5 μm, ב-55 kVp, 145 uA עם 1000 תחזיות לכל 180 ° באמצעות סיבוב רציף, ועם זמן שילוב של 200 מילישניות, והתוצאה היא מקסימום של מגוון של 213 לסריקה. סריקות שבוצעו בניסוי זה הם כ 9 דקות ארוך. זרם חשמלי מופחת יכול להיות מפוצה עם זמן האינטגרציה באופן פרופורציונלי, אך יגרום לזמני סריקה ארוכים יותר.
  4. להשאת העכבר המבוגר באמצעות isofלאנה; בתחילה מורדם ב 3% בחדר, ואחריו 1.5% isof, המסופק לחדר החיות μCT במשך הסריקה. בעדינות למקם את העכבר בחדר החיות μCT עם הספרות האחרונות מסודרים שיוך קרוב, שטוח, צד ולמעלה עם כף יד שמאל על צד שמאל יד ימין בצד ימין על פלטפורמת הסריקה, ואחריו בעדינות לאבטח את הספרות במקום באמצעות כירורגי קלטת. החלת משחה אופטלמולוגית על העיניים כדי למנוע יובש תוך כדי הרדמה.
  5. להחזיר את העכבר לכלוב נקי לפקח על העכבר עד הערה. המשך לסרוק את אותו העכבר ב-bi-שבועי לנקודות זמן שבועיות כדי להמחיש את תגובת העצם כולה התחדשות.
  6. לאחר הסריקה, לאפשר עד מספר שעות עבור שחזור תמונה μCT להתרחש. באמצעות התוכנה המסופקת μCT, המר את הקבצים לסידרה של קבצי dicom; כל קובץ dicom יתאים פרוסה אחת של הסריקה, ולכן, אם 213 פרוסות נסרקו, 213 קבצים dicom ייווצרו ויועלו לשרת של החברה.
  7. הורד את סדרת dicom בתיקייה אחת באמצעות אצווה קובץ ההורדה בדפדפן אינטרנט.
  8. הורד את התוסף הגרוטאות23 וגרור את הקובץ לתוך התיקייה imagej plugin. ב-ImageJ, פתח את סידרת הקבצים dicom כערימה על-ידי גרירה ושחרור התיקיה לסרגל ImageJ. מחסנית תמונות של 16 סיביות המציגה את כל ערכי האפור תיפתח. כדי להציג עצם בלבד, לבצע תמונה סף (Image > להתאים את הסף > ).
    הערה: בעת הצגת קבצי ImageJ, הפלט ImageJ יתאים לתמונה הפוכה של הספרות; i.e., ספרות מסודרים פלטפורמת סריקה ומצד למעלה-up, עם כפה שמאל בצד שמאל של הפלטפורמה כפה ימין בצד ימין של הפלטפורמה, יופיע בתור בצד השמאלי, יד ימין על צד שמאל ושמאלה כפה בצד ימין של מחסנית תמונה ImageJ.
  9. לאחר פתיחת תיבת הדו של הסף, החלק את הסרגל התחתון, המתאים לסף העליון, לימין הרחוק, והתאם את הפס העליון, המתאים לסף התחתון, עד שהעצם יסומן באדום בלבד. ערך הסף התחתון יהיה כ 10000 – 13000 בעוצמת אות מקסימלית של 32,767. לחצו על ' החל' ובתיבת הדו החדשה לחצו על ' רקע שחור'. לחץ על אישור.
  10. תמונה של 8 סיביות המציגה ערכי שחור-לבן תיווצר, עם לבן המתאים לעצם. בחר את העצם P3 על-ידי ציור מלבן סביבו ושכפל את המחסנית. יצירת תמונה תלת-ממדית (תוספים ≫ מציג תלת-ממד). לחיתוך עצם לא מיותרת מהתמונה, לחצו על כלי הבחירה ביד חופשית והקיפו את העצם למחיקה. לחצו לחיצה ימנית ובחרו ' מילוי בחירה ' למחיקת עצם.
    הערה: השלבים המתוארים לעיל חלים על ImageJ 1.52 h, Java 8 ועשויים להיות שונים במקצת בעת שימוש בגירסה שונה של ImageJ. עבור סף, אנו ממליצים על קביעת ערך אופטימלי ושימוש בערך זה בעקביות.
  11. העצם מכמת נפח הרינדור תלת-ממד באמצעות החלק של עוצמת השבר בנפח העצמות (תוספים > ב> נפח הגרוטאות ). חלון התוצאה יופיע, ונפח העצם (BV) יוצג ב-mm3.
  12. מכמת אורך עצם מעיבוד תלת-ממד באמצעות הכלי ImageJ מרובה נקודות.
    הערה: אורך העצם הוא דינמי במהלך התחדשות P3; האורך מקטין בין 7-10 DPA הקשורים עם osteoclast-בתיווך העצם השפלה11, והוא אחריו תקופה של לצמיחה מחודשת העצם בין 14-28 dpa (איור 3b). אורך נמדד מהבסיס המרכזי של P2/P3 משותף לנקודה הרחוקה ביותר של מינרליזציה בקודקוד העצם המרוחק, אך אינו כולל עצם מושפל כי כבר מנותקת לחלוטין (איור 3B). העצם מאפשרת הערכה מלאה תלת-ממדית של ארכיטקטורת העצמות; כך, את הזווית שבה העצם נסרק לא לשנות את היכולת למדוד אורך.
  13. לכידת תמונה של עיבוד תלת-ממד על-ידי לחיצה על תצוגהוצילום תמונה. שמור תמונה כקובץ tif או jpeg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עכבר למבוגרים מתחדשות P3 ספרות ב 6/7 DPA (איור 2A-D), 9 Dpa (איור 2a-H), ו 10 dpa (איור 2a-L) היו מוכתמים בנוגדנים ל Runx2, OSX, ו pcna להמחיש intramembranous עצם התחדשות, ומוכתם בנוגדנים ל CXCR4 ו-vWF כדי להמחיש היווצרות blastema. הנציג μCT העיבודים של ספרות שנסרקו לפני קטיעה ובנקודות זמן שונות במהלך התחדשות (איור 3A, B) וזיהוי של ציוני דרך המשמשים לזיהוי מדידות אורך (איור 3a) הם גם מוצג.

Figure 1
איור 1: מספר ספרה וזיהוי של עכבר מבוגר מP3 קטיעה מישור. העכבר המבוגר בימין הרגל הימנית מוצג עם ספרות ממוספרים 1-5; קטיעות שבוצעו במחקר זה מתבצעות בספרות 2 ו-4 (א). מטוס הקטיעה המרוחק P3 מוצג (קו מקווקו) בספרות 2 ו-4 (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מוקדם intramembranous להתקשות ו blastema היווצרות בעכבר למבוגרים מתחדשות, ספרות P3. Runx2 (ירוק) ו-PCNA (מגנטה) כפול immunofluorescence מראים כי מתרבים osteoprogenitors הם בתחילה מקומי כדי קרום העצם לגנוב ומשטחי עצמות בשעה 6/7 DPA, ולהרחיב את הדיבלסטמה ב 9 ו 10 DPA (A, E, אני). OSX (ירוק) ו-PCNA (מגנטה) כפולה immunofluorescence להראות מעטים OSX-חיוביים אוסטאופנית והתפשטות רחבה ב 6/7 (ב), ומשופר osx מכתים הצביעת מוגבל על ידי תאים מתרבים ב 9 ו 10 Dpa (F, J). CXCR4 (אדום) החיסונית מזהה היווצרות blastema מוקדם ב 6/7 DPA (ג), ואחריו CXCR4 חיסונית חזקה ב 9 ו 10 dpa מתחדשות ספרות (G, K). vwf (ירוק) חיסוני מזהה יום שלמים במח של ספרות קטוע, ומספר תאים חיוביים המשויכים נמק העצם blastema (D, H, L). דוגמאות מוכתמות באמצעות DAPI. , החלק העליון למעלה. המרוחק מימין Bl = blastema, m = מח עצם. קנה מידה ברים = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: התחדשות העצם P3 דמיינו על ידי סדרתי ב-Vivo μCT סריקה. הנציג μCT העיבודים של ספרה אחת נסרקה לפני קטיעה (unamp), ו ב 1, 7, 10, 14, 21, ו-28 DPA. הסריקה μCT מדגים התחדשות P3 מאופיין על ידי תגובת העצם הראשונית התגובה, ואחריו האי עצם היווצרות ב 14 DPA והתחדשות עצם חזקה ב 21 ו 28 DPA (א). הנציג μCT הרישום של ספרה אחת נסרק לפני קטיעה ו ב 1, 7, 10, 14, 21 ו 28 DPA מציג את האזורים שבהם אורך הספרה נמדד בכל נקודה. (ב) נקודות ירוקות לציין את אורך כולל נמדד, בעוד X אדום מציין את האזור של עצם גורשו נשלל ממדידת אורך. ניתן לחתוך תמונות ספרות בודדות שנוצרו על-ידי ImageJ כדי לתקנן את גודל הספרה כדי לאפשר יצירה של תמונות הנמצאות באיור זה. . זה מימין, הראש למעלה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר הליך מתוקננת של העכבר המבוגר הP3 קטיעה, כתמים מבוססי פלורסנט מכתים כדי להמחיש ולחקור היווצרות blastema ו intramembranous האוסיפיקציה, ו רציפים ב-vivo μct סריקה כדי ל זיהוי עצם מורפולוגית, נפח, ואורך שינויים לאחר קטיעה. P3 קטיעה הוא ייחודי, תהליכים פשוטה, מודל ליצירת לנתח סביבה פרו-משובי הפצע המפעיל היווצרות blastema. יתרה מזאת, מודל הספרות P3 מציע יתרונות רבים על פני מודלים לפגיעה בעצם מסורתית כדי לחקור intramembranous האוסיפיקציה.

כדי להבטיח הצלחה של פרוטוקול זה, יש לבצע decalcification ספרה מלאה. במקרה שהספרה אינה מלאה בשלמות, היא תתפורר ותגרוס במהלך התהליך. בנוסף, החום אחזור האימונוהיסטוכימיה יכול להיות בעייתי בכך הרקמות עלול להתנתק מעט או להיות מתנתק לחלוטין מן השקופית. כדי להקל על בעיה זו, הדגימות צריך להיות רכוב על שקופיות דבק באמצעות אמבט מים שיושלם עם סוכן דביק היסטולוגית, כמו גם אפייה את השקופיות יבש 65 ° צ' לפני השימוש. לבסוף, הספרות העכבר קטנות יחסית; לכן, כדי להמחיש במדויק שינויי מורפולוגיה ומכמת בנפח העצם ואורכו, μCT חייב להיות ברזולוציה מספקת כדי לתפקד בפרמטרי הסריקה המתאימים.

מגבלה אחת של שיטה זו היא כי לא כל הנוגדנים העיקריים תואמים קיבוע רקמות עיבוד פרפין. במקרה זה, תקן קריוסטסיטת רקמות קפוא ניתן לבצע כדי להבטיח את שלמות של אנטיגן הנוגדן העיקרי11. קריוסקר גם מבטלת את הצורך בצעד decalcification, אולם גילינו כי ההקפאה של הספרות היא מבחינה טכנית מאתגרת יותר מאשר פרפין.

בלסטמה כולו יכול להיות מדמיין בהגדלה של 10 x על ידי פירוק מיקרוסקופ, ו, באמצעות תוכנת כימות התמונה המתאימה, תוצאות מכתים החיסוני ניתן לכמת בקלות. בדיקת אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית לסמנים אוסטגניים של הספרה התחדשות מספק תצוגה ייחודית של בידול בלייסטאל דרך intramembranous האוסיפיקציה. מכתים אימונוהיסטוכימיה חושף את תגובת P3 העצם התחדשות מקוטב ותוצאות היווצרות מאורגן מתחת לעצם המבנה (איור 2). בשלבי התחדשות מאוחר יותר, האוסטאופטים שאינם מתרבים הנגזרים מהבלסטמה הם מקומיים הסמוכים לגדם העצם והם מוגבלים באמצעות מתרבים אוסטאופנית. האוסטאופנית מתרבים, בתורו, הם מוגבלים באמצעות מתרבים תאים מובחן בלייסטאל. כימיה פלורסנט בודק עבור הסמן blastema CXCR4 מזהה תאים blastema מוקדם הקשורים למשטח העצם הפצוע ואחריו כתמים חיסוניים משופר בשלבי התחדשות מאוחר יותר (איור 2). Blastema הוא נמק העצם13 ו immunofluorescence סנס לסמן תא אנדותל vwf מזהה כמה תאים חיוביים בתוך אזור blastema (איור 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים לחברי מעבדת Muneoka ומכון טקסס לרפואה גנומית (TIGM). העבודה הזאת נתמכת על ידי אוניברסיטת טקסס A & M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein Block Serum Free DAKO X0909 Ready to use
Mouse anti-PCNA antibody Abcam ab29 1:2000 dilution
Rat anti-CXCR4 antibody R&D Systems MAB21651 1:500 dilution
Rabbit anti-human vWF XIII antibody DAKO A0082 1:800 dilution
Rabbit anti-osterix, SP7 antibody Abcam ab22552 1:400 dilution
Rabbit anti-Runx2 antibody Sigma-Aldrich Co. HPA022040 1:250 dilution
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A21235 1:500 dilution
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A11008 1:500 dilution
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Invitrogen A11077 1:500 dilution
Prolong Gold antifade reagent Invitrogen P36930 Ready to use
Surgipath Decalicifier 1 Leica Biosystems 3800400 Ready to use
Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative Anatech LTD 174 Ready to use
CD-1 Female Mouse Envigo ICR(CD-1) 8-12-weeks-old
vivaCT 40 SCANCO Medical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
  2. Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).
  3. Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
  4. Neufeld, D. A., Zhao, W. Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation. Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).
  5. Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).
  6. Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
  7. Chamberlain, C. S., et al. Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx. Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).
  8. Dawson, L. A., et al. Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice. Regeneration. 3, 39-51 (2016).
  9. Seifert, A. W., Muneoka, K. The blastema and epimorphic regeneration in mammals. Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).
  10. Carlson, B. M. Principles of Regenerative Biology. , Elsevier. Burlington, MA. (2007).
  11. Fernando, W. A., et al. Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice. Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).
  12. Simkin, J., et al. Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration. Regeneration. 2, 106-119 (2015).
  13. Yu, L., et al. Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration. Regeneration. 1, 33-46 (2014).
  14. Dolan, C. P., et al. Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice. Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).
  15. Dawson, L. A., et al. Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).
  16. Sammarco, M. C., et al. Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).
  17. Einhorn, T. A. The science of fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).
  18. Shapiro, F. Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts. European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).
  19. Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).
  20. Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).
  21. Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine. Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).
  22. Lee, J., et al. SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2. Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).
  23. Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47, 1076-1079 (2010).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 149 ספרה קטיעה התחדשות אפימורפי הintramembranous פיקציה osteoprogenitors בלסטמה decalcification כימיית קרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מיקרומחושבת
כריתה של ספרות עכבר למבוגרים והתחדשות: מודל פשוט כדי לחקור ממגי בלסטאמה היווצרות הIntramembranous פיקציה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dawson, L. A., Brunauer, R., Zimmel, … More

Dawson, L. A., Brunauer, R., Zimmel, K. N., Qureshi, O., Falck, A. R., Kim, P., Dolan, C. P., Yu, L., Lin, Y. L., Daniel, B., Yan, M., Muneoka, K. Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification. J. Vis. Exp. (149), e59749, doi:10.3791/59749 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter