Summary
Здесь мы представляем протокол ампутации фаланги терминала для взрослых мышей для исследования образования бластемы млекопитающих и интрамембранной окостенации, анализируемый флуоресцентной иммуногистохимией и последовательной микрокомпьютерной томографией in-vivo.
Abstract
Здесь мы представляем протокол взрослой мыши дистальной терминальной фаланги (P3) ампутации, процедурно простой и воспроизводимой модели эпиморфной регенерации, которая включает в себя формирование бластемы и интраимбранное окосяждение, проанализированные флуоресценция иммуногистохимия и последовательная микрокомпьютерная томография in-vivo (ККТ). Регенерация млекопитающих ограничивается ампутациями, трансектирующие дистальную область терминальной фаланги (P3); цифры, ампутированные на более проксимальных уровнях, не могут регенерировать и проходят фиброзное заживление и образование рубцов. Реакция регенерации опосредована образованием пролиферативной бластемы, а затем регенерацией костей через интраимбранную окостенение для восстановления ампутированной скелетной длины. Ампутация P3 является доклинической моделью для исследования эпиморфной регенерации у млекопитающих, и является мощным инструментом для разработки терапевтических стратегий для замены фиброзного исцеления с успешной регенеративной реакции. Наш протокол использует флуоресценцию иммуногистохимии 1) определить ранне-поздние популяции бластемных клеток, 2) исследование реваскуляризации в контексте регенерации, и 3) исследовать интраммбранную окостенение без необходимости сложной кости стабилизационные устройства. Мы также демонстрируем использование последовательного in vivo зКТ для создания изображений с высоким разрешением для изучения морфологических изменений после ампутации, а также количественной оценки изменений объема и длины одной и той же цифры в ходе регенерации. Мы считаем, что этот протокол предлагает огромную полезность для исследования как эпиморфных, так и регенеративных реакций тканей у млекопитающих.
Introduction
Млекопитающие, в том числе люди и мыши, имеют возможность регенерировать кончики своих цифр после дистальной ампутации терминальной фаланги (P3)1,2,3. У мышей реакция регенерации зависит от уровня ампутации; все более проксимальной ампутации цифрототвают постепенно ослабленный регенеративный ответ до полного регенеративного отказа при ампутации трансэктинга и проксимальной к матрице ногтей P34,5,6 , 7 (г. , 8. Регенерация P3 опосредована образованием бластемы, определяемой как популяция размножающихсяклеток, которые проходят морфогенез для регенерации ампутированных структур 9. Формирование бластемы для регенерации структур, потерянных в результате ампутации, процесс, называемый эпиморфной регенерации, отличает многотканьья уровня P3 регенерации ответ от традиционного восстановления тканей после травмы6, 10. Регенерация P3 является воспроизводимой и процедурно простой моделью для исследования сложных регенеративных процессов, включая заживление ран11,12,гистолиза костей11,12, реваскуляризации13, периферической регенерации нерва14, и бластремальной преобразования в кости через интраимбранную окостенение15.
Предыдущие исследования с использованием иммуногистохимии показали, что бластема неоднородна, аваскулярная, гипоксическая и высоко размножается11,13,15,16. После дистальной ампутации P3, ранняя бластема первоначально связана с периостеем P3 и эндостерией и характеризуется устойчивым распространением и зарождающимся остеогенезом, примыкающим к костной поверхности15. После деградации костей и замыкания раны, неоднородная бластема формируется в результате слияния периохальных и эндостел-ассоциированных клеток, за которыми следует дифференциация бластремальных компонентов, включая кости через интраимбранное окосоединение 15.
Ремонт костей в ответ на травму обычно происходит путем эндохондральной околения, т.е. через первоначальный хрящевой каллуса, который образует шаблон для последующего формирования костей17,18. Длинная косточка интраимбранной оковласти, т.е. формирование костей без хрящевого промежуточного, обычно индуцируется с помощью сложных отвлекающих устройств или хирургической фиксации19,20. Цифра регенерации ответ является доклинической моделью, которая предлагает преимущества по сравнению с обычными интраимбранной окотопительных моделей: 1) он не требует внешней или внутренней фиксации после травмы, чтобы стимулировать интраимбранной оковласти, 2) это выполняется с использованием 4 цифр от каждого животного, тем самым максимизируя образцы при минимизации использования животных, и 3) последовательный анализ микрокомпьютерной томографии in vivo (ККТ) может быть выполнен с легкостью и скоростью.
В настоящем исследовании мы показываем стандартизированную плоскость ампутации P3 для достижения воспроизводимой и надежной реакции регенерации. Кроме того, мы демонстрируем оптимизированный протокол иммуногистохимии флуоресценции с использованием парафиновых секций для визуализации образования бластемы, реваскуляризации в контексте регенерации и бластремального преобразования в кости через интраимбранные опрокидолизм. Мы также демонстрируем использование последовательного in-vivo зКТ для выявления изменений в морфологии костей, объеме и длине в одной и той же цифре в течение регенерации. Целью этого протокола является исследование образования бластеммлекопитающих после ампутации и демонстрация 2 методов, флуоресценции иммуногистохимии и последовательной in vivo зКТ, для изучения интраимбранной регенерации костей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все виды использования и методы использования животных соответствовали стандартным оперативным процедурам Институционального комитета по уходу за животными и использованию Техасского университета.
1. Взрослая мышь Хинд Лимб Дисталь P3 Ампутация
- Анестезия от 8 до 12 недель CD-1 мыши (Таблица материалов) с использованием изофруранового газа в кислороде; первоначально анестезируют на 3% в камере, а затем 2% изолюран поставляется носекон в течение всего срока операции. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость в состоянии наркоза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослые исследования ампутации P3, стандартизированные в нашей лаборатории, проводятся на мышах от 8 до 12 недель, и реакция на регенерацию сохраняется во всех испытанных штаммах. - Под 10-кратным микроскопом вскрытия стерилизовать цифры задней конечности хирургическим повидон-йод и 70% этанола. Обрезать волосы от хирургического участка с помощью микро-ножниц. Нанесите 1 зл местного Bupivacaine локально для обезболиваемого хирургического сайта.
- Ампутировать дистальный кончик терминальной фаланги (P3) на цифрах 2 и 4 каждой задней конечности с помощью стерильного #10 скальпеля(рисунок 1A). Ампутация должна проводиться в асептических условиях, включая стерилизацию хирургических инструментов. Под микроскопом вскрытия, осторожно splay заднюю лапу, чтобы разоблачить медиальную поверхность цифры. Держите скальпель под углом параллельно fatpad для выполнения ампутации показано на рисунке 1B. Нанесите 1 зл местного bupivacaine на место ампутации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ампутация трансектирует орган ногтя, дерму, кость P3, сосуды и нервы, но не перекрывает полость костного мозга или цифру жира площадку. При обнаружении кровотечения нанесите прямое давление с помощью стерильного аппликатора кончика хлопка. - Стандартная плоскость distal ампутации P3 извлекает приблизительно 15%-20% от тома косточки P321. Сканирование микроКТ (см. ниже) может быть выполнено для подтверждения правильной длины ампутации.
- Верните мышь в чистую клетку и дайте ране зажить без рана. Мониторинг мыши в течение 3 дней, чтобы гарантировать, что мышь возвращается к нормальной деятельности.
2. Коллекция и подготовка тканей
- Эвтанизировать мышь с помощью углекислого газа (CO2) в закрытой камере, а затем вывих шейки матки.
- Используйте скальпель, чтобы разорвать цифру на полпути через соседний сегмент кости, средняя фаланга (P2) кости, примерно на второй вентральный жир нойне отступ. Передача цифры (ы) на 20 мл сцинтилляционный флакон, содержащий 10 мл свежего буферизированного цинка формалина фиксатора, 18% формальдегида (см. Таблица материалов). Фиксативный объем должен быть не менее 20 раз объем ткани настоящее время.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цифры собираются в различных временных точках после ампутации, чтобы исследовать полный ответ регенерации. Как правило, для раннего образования бластемы, костного гистолиза и закрытия раны временные точки сбора составляют 4-8 дней после ампутации (DPA). Для исследования ранней остеогенной бластемы временные точки сбора 9 и 10 DPA, а также для визуализации продолжающейся регенерации костей и минерализации, временные точки сбора 14, 21 и 28 DPA. Также собираются неампутиемые цифры. - Исправьте цифру для 24-48 h при комнатной температуре с нежным смешиванием на шейкере.
- Удалить фиксатор и мыть цифру 2x в течение 5 минут в 5 мл 1x фосфат буферного сольника (PBS) при комнатной температуре.
- Поместите 10 мл свежего декальцификатора I (см. Таблицаматериалов), 10% для раствора для кислоты, в сцинтилляционный флакон и аккуратно перемешайте на шейкере в течение 2 ч при комнатной температуре. После 2 ч замените Decalcifier I свежим раствором и рассеивайте цифру на ночь при комнатной температуре с нежным смешиванием на шейкере.
- Удалите Декальциатор I и вымойте цифру 2x в течение 5 минут в 5 мл 1x PBS при комнатной температуре.
-
Обработка цифры с помощью градуированных этанола серии. Этот процесс может быть выполнен вручную в 20 мл сцинтилляции флакон, используя 10 мл каждой жидкости, если менее 40 общих цифр.
- Начните с 2 погружений в свежий 70% этанола при комнатной температуре с нежным смешиванием на шейкере, 1 ч каждый, а затем 2 погружения в свежие 95% этанола при комнатной температуре с нежным смешивания на шейкере, 1 ч каждый.
- Завершите обезвоживание цифры с 2 стирки свежего 100% этанола при комнатной температуре с нежным смешивания на шейкере, 1 ч каждый. Окончательный 100% этанола мыть можно оставить на ночь.
- В том же сцинтилляционном флаконе замените 100% этанол на 10 мл свежих ксиленов и поместите флакон в химический дымовой капот на 1,5 ч при комнатной температуре. Повторите со свежей стирки ксиленов в химическом капоте дыма на 1,5 ч при комнатной температуре в общей сложности 2 моет.
- Замените ксиленовыжи жидким парафиновым воском, расплавленным до 68 градусов по Цельсию, и поместите флакон в инкубатор при температуре 68 градусов по Цельсию в течение 2 ч, 2 раза. После 4 всего ч погружения в парафин воск, вставлять цифру для парафинов секции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка дигитологии для гистологии может выполняться в автоматизированном процессоре, следуя этим же рекомендациям. - Сечение цифр ы толщиной 4-5 мкм с помощью микротома. Поместите секционированные образцы на клеевые горки, используя водяную ванну 38–41 градусов, дополненную гистологическим клеевым раствором, чтобы убедиться, что образцы прилипают к слайду. Поместите слайды на слайде 37 градусов по Цельсию теплее, чтобы высохнуть.
3. Иммуногистохимическое окрашивание взрослых маустрдляных дигитов для расследования формирования Бластемы и интраимбранной осификации
- Тепло секционированные горки при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 45 минут, а затем отопление при температуре 37 градусов по Цельсию в течение не менее 15 минут, чтобы обеспечить присоединение образцов к слайду.
- Депарафинизацию и регидратные горки 2x с 5 мин омывает ксилен, градуированный этанол серии, и погружение в воду. Место слайды в 50-100 мл емкость окрашивания банку и держать погружен в 1x Tris Buffered соленя с Tween 20 (TBST).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте высыхания образцов на протяжении всего процесса окрашивания. На любом этапе TBST слайды могут быть инкубированы до 2 ч. - Подготовьте увлажняющую камеру. 1-дюймовый глубокий покрытый пластиковый слайд-бокс с увлажненной бумагой ткани в основании достаточно.
- Подготовьте решение для поиска тепла для Runx2, Osterix (OSX) и распространяющегося клеточного ядерного антигена (PCNA). Для поиска антигена раннего маркера остеопрогенитора, Runx2, приготовьте 1x раствор Tris-EDTA, pH 8. Для остеобластного маркера, OSX, приготовьте 1x раствор цитратного буфера, рН 6. PcNA иммуностоинга может быть выполнена в любом растворе.
- Подготовка Proteinase K антигена поиска решение для бластемы маркер CXCR422 и эндотелиальный маркер клеток фон Виллебранд фактор 8 (vWF) путем размещения 100 зллю Раствора Proteinase K на слайд в микроцентрифуге трубки и отопления до 37 градусов по Цельсию (приблизительно 5 мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Извлечение антигена для Runx2, OSX и PCNA выполняется с использованием теплового поиска, а извлечение антигена CXCR4 и vWF осуществляется с помощью лечения протеиназа K. - Для поиска антител, требующих тепла, погрузите слайды в окрашивание банку в соответствующий антиген поиска решения. Тепло скользит до 95 градусов по Цельсию в течение 25 минут, обеспечивая кипения не происходит. Снимите банку с окрашивающей сярочками из источника тепла и дайте остыть при комнатной температуре в течение 35 мин.
- Для поиска антигена Proteinase K, положите слайды плоские в увлажняющей камере, и поместите 100 л предварительно подогретой Протеиназа K на слайде. Обложка слайды с небольшой полосой парафильма для обеспечения слайды не становятся сухими. Инкубировать горки в течение 12 мин при 37 градусах Цельсия.
- Вымойте слайды 3 раза в течение 5 минут в 1x TBST в окрашивание банку после поиска антигена.
- Удалите слайды из окрашивающей банки и поместите в увлажняющую камеру. Поместите 6-7 капель блокирующего раствора(Таблицаматериалов) на слайд, и накройте слайд свежей парафинаю пленкой, чтобы слайд не стал сухим. Инкубировать горки для 1 ч при комнатной температуре.
- Подготовка первичных антител путем разбавления антител в разбавитель антител (Таблица материалов). Vortex каждый основной антитела решение для 3 s. Первичные антитела, полученные из различных видов хозяина могут быть объединены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуногистохимическое окрашивание для Runx2 (антитела кролика anti-Runx2, 1:250 разбавления, при конечной концентрации 4 мкг/мл) в сочетании с PCNA (моноклональные мыши анти-PCNA антитела, 1:2,000 разбавления, при окончательной концентрации 0,5 мкг/мл), и OSX (кроличи anti-OSX) антитела, 1:400 разбавления, при окончательной концентрации 0,125 мкг/мл) в сочетании с PCNA показано на рисунке 2. Мышь анти-PCNA антитела, используемые в этом исследовании является весьма конкретным и не требует дополнительных блокирующих шагов за пределами тех, изложенных в этом протоколе. Иммуногистохимическое окрашивание с использованием CXCR4 (крыса анти-CXCR4 антитела, 1:500 разбавления при окончательной концентрации 2 мкг/мл) и vWF (кролик анти-человеческих vWF VIII антитела, 1:800 разбавления, при окончательной концентрации 41,25 мкг/мл) показано на рисунке 2. Первичные антитела были оптимизированы и протестированы нашей лабораторией в соответствии с условиями этого протокола и перечислены в таблицематериалов. - Тщательно удалите парафина пленки, и осторожно слить слайд на бумагу ткани, чтобы удалить избыток блокирующего раствора. Поместите 100-200 л первичного раствора антитела на слайд, замените крышку парафильма и вернитесь в увлажняющую камеру. Инкубировать горки в закрытой увлажняющей камере на ночь при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте слайдам высохнуть при сливе блокирующего раствора. Этот шаг выполняется быстро. - Аккуратно снимите парафильм и аккуратно слейте основной раствор антитела со слайда. Поместите слайд в окрашивание банку, содержащую свежие 1X TBST. Вымойте свежим 1x TBST в течение 5 мин 3 раза.
- Подготовка вторичных антител, сочетая с разбавителем антител (Таблица материалов). Vortex вторичный раствор антитела для 3 s. Вторичные антитела спрягать к по-разному флюорофорам выведенным от по-разному видов могут быть совмещены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные вторичные антитела светочувствительны. Alexa Fluor 488-конъюгированный коза анти-кролик IgG (H'L) для Runx2, OSX, и vWF, Alexa Fluor 568-конъюгированный коза анти-крыса IgG (H'L) для CXCR4, и Alexa Fluor 647-конъюгированный коза анти-мышь IgG (H'L) для PCNA, разбавленный в 1:500 с окончательной концентрацией 4 мкг/мл , были использованы в рисунке 2. - Поместите 200 зл вторичного раствора антитела на слайд, накройте слайд свежей парафинаи пленкой и вернитесь к увлажняющей камере. Инкубация горки в закрытой увлажняющей камере в течение 45 минут при комнатной температуре. Убедитесь, что увлажняющая камера закрыта, чтобы избежать света.
- Аккуратно снимите парафина пленки и осторожно слейте вторичный раствор антитела со слайда. Поместите слайд в окрашивание банку, содержащую свежие 1x TBST. Вымойте со свежим 1x TBST в течение 5 мин 3x. Избегайте света.
- Приготовьте ядерное пятно. Добавьте 20 кЛ DAPI (запас DAPI раствор 5 мг/мл в H2O) до 200 мл 1x PBS и энергично встряхните, чтобы обеспечить однородность. Погружение слайдов в течение 5 минут в dAPI-PBS решение. Избегайте света.
- Вымойте слайды в dH2O в течение 3 мин. Декант воды и позволяют слайды воздухсухой или мягко аспирировать воду из слайда, гарантируя, что образцы не нарушается во время пылесосить. Избегайте света.
- Тщательно coverslip сухие слайды с использованием 100 злител анти-увядание монтажа среды (Таблица материалов); избегать образования пузырьков воздуха на слайде во время монтажа шага. Храните слайды плоские и позволяют монтаж среды высохнуть на ночь при комнатной температуре в светонепроницаемый контейнер. После того, как монтажная среда сухая, храните слайды плоскими в светонепроницаемом контейнере в 4 кв с до готовности к просмотру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если неприемлемые уровни пузырьков воздуха присутствуют после монтажа, установленная горка может быть аккуратно помещена в 1x PBS, крышка может быть удалена, и как только слайд снова промыть в воде и повторно высушить, может быть повторно установлен.
4. Микроскопия и анализ изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте используется изображение и анализ с использованием флуоресцентного микроскопа деконволюции и связанного с ним программного обеспечения, оснащенного 3 флуоресцентными фильтрами (для визуализации Alexa Fluor 488, 568 и 647 нм сигналов), а также DAPI (419 нм).
- Изображение слайда на 10x увеличение, чтобы захватить весь регион blastema.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пролиферации остеобластов первичного обнаружения антител использует вторичные антитела (Alexa Fluor 488 и 647) с неперекрывающихся спектров выбросов, чтобы свести к минимуму неправильную идентификацию совместно обозначенных клеток. Фоновое вычитание автофлуоресцентного сигнала может быть выполнено с помощью фильтра 568 нм для обеспечения целостности сигналов 488 или 647. Blastema первичного обнаружения антител использует вторичные антитела (Alexa Fluor 488 или 568). Фоновое вычитание автофлуоресцентного сигнала может быть выполнено с помощью фильтра 568 при использовании 488-конъюгированного антитела, а 488 фильтр использует 568-конъюгированное антитело. Автофлуоресцентный сигнал обычно ассоциируется с ногтевой пластиной и эритроцитами на протяжении всей цифры, и наблюдается в 488, 568 и 647 фильтров.
5. Последовательная в Vivo Микрокомпьютерная томография (ККТ)
- Регенерирующие цифры одного и того же животного, отсканированного за 1 день до ампутации (неампутительная), 1 DPA, и в разное время до полной регенерации в 28 DPA с использованием vivaCT 40 (Таблица материалов) выполняется в этом эксперименте и показано в Рисунок 3A.
- Обнаживать ККТ с трубками, чтобы позволить поток кислорода в и из камеры животных, гарантируя, что вытекающий кислород оснащен активированным угольным фильтром для ловли изолюрани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что камера для животных плотно огорожена; таким образом, животный нос-конус не требуется для поставки изофлюран для мыши во время сканирования. - Подготовьте параметры сканирования ККТ. Цифры сканируются при вокселе размером 10,5 мкм, при 55 кВп, 145 uA с 1000 проекциями на 180 градусов с помощью непрерывного вращения и с временем интеграции 200 мсsec, в результате чего максимум 213 ломтиков на сканирование. Сканирование, выполненное в этом эксперименте, составляет около 9 минут. Снижение электрического тока может быть компенсировано пропорционально увеличенным временем интеграции, но приведет к увеличению времени сканирования.
- Анестезия взрослой мыши с помощью изофлюран; первоначально анестезируют на 3% в камере, а затем 1,5% изолюран поставляются в камеру животных зКТ в течение всего срока сканирования. Аккуратно поместите мышь в камеру животных с задними цифрами, расположенными в тесной ассоциации, плоской, брюшной боковой стороной с левой лапой на левой стороне и правой лапой на правой стороне на сканирующей платформе, а затем мягко обеспечения цифр на месте с помощью хирургического хирургического Ленты. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость в состоянии наркоза.
- Верните мышь в чистую клетку и следите за мышью до пробуждения. Продолжить сканирование той же мыши на два раза в неделю в еженедельные точки времени, чтобы визуализировать весь ответ регенерации костей.
- После сканирования, дайте до нескольких часов для реконструкции изображения. Используя программное обеспечение, предоставляемое с кКТ, преобразовать файлы в серию файлов dicom; каждый файл dicom будет соответствовать одному фрагменту сканирования, поэтому, если 213 срезов были отсканированы, 213 файлов dicom будут сгенерированы и загружены на сервер компании.
- Загрузите серию dicom в одной папке с помощью загрузчика пакетных файлов в веб-браузере.
- Скачать плагин BoneJ23 и перетащите файл в папку плагина ImageJ. В ImageJ откройте серию файлов dicom в виде стека, перетащив папку в бар ImageJ. 16-битный стек изображения, отображающий все серые значения, будет открыт. Для отображения только кости, выполнять изображение порогового значения (ямага
ПРИМЕЧАНИЕ: При просмотре файлов ImageJ выход ImageJ будет соответствовать перевернутому изображению цифр; т.е. цифры, расположенные в сканирующей платформе ventral side-up, с левой лапой на левой стороне платформы и правой лапой на правой стороне платформы, будут выглядеть как дорсальная сторона вверх, правая лапа на левой стороне и левая лапа на правой стороне стека изображений ImageJ. - Как только пороговое поле диалогового окна открывается, сдвиньте нижнюю панель, соответствующую верхнему порогу, в крайнем правом углу, и отрегулируйте верхнюю планку, соответствующую нижнему порогу, пока только кость не будет выделена красным цветом. Нижнее пороговое значение составит примерно 10 000–13 000 при максимальной интенсивности сигнала 32 767. Нажмите применить, и в новом диалоговом поле нажмите черный фон. Нажмите OK.
- Будет создано 8-битное изображение, отображающее черно-белые значения, с белым цветом, соответствующим кости. Выберите кость P3, нарисовав прямоугольник вокруг нее, и дублируйте стек. Создайте 3D-изображение (Плагины ( 3D Viewer). Чтобы обрезать любую ненужную кость из изображения, нажмите инструмент выбора от руки и обведите кость, чтобы быть удалены. Нажмите правой кнопкой мыши, и выберите Заполнить выбор, чтобы удалить кости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанные выше шаги применяются к ImageJ 1.52h, Java 8 и могут незначительно отличаться при использовании другой версии ImageJ. Для порогового значения мы рекомендуем определить оптимальное значение и использовать это значение последовательно. - Количественное объем кости от 3D рендеринга с помощью BoneJ Том Фракция Плагин (Плагины Появится окно результата, а объем кости (BV) будетотображаться в мм 3.
- Количественная длина костей от 3D-рендеринга с помощью многоточечного инструмента ImageJ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длина костей динамическая в течение регенерации P3; длина уменьшается между 7-10 DPA, связанных с остеокласт-опосредованного деградации костей11, и сопровождается периодом дистального отрастания костей между 14-28 DPA (Рисунок 3B). Длина измеряется от центрального основания соединения P2/P3 до самой дальней точки минерализации на дистальной вершине кости, но не включает деградированную кость, которая была полностью отделена(рисунок 3B). BoneJ позволяет полную 3D-оценку костной архитектуры; таким образом, угол, в котором сканируется кость, не изменит способность измерять длину. - Захват изображения 3D визуализации, нажав Навид,и сделать снимок. Сохранить изображение в виде файла tif или jpeg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Взрослая мышь регенерирующих P3 цифры на 6/7 DPA(Рисунок 2A-D), 9 DPA (Рисунок2E-H), и 10 DPA (Рисунок 2I-L) были иммуноокрашены антителами к Runx2, OSX, и PCNA для визуализации интрамбранной кости регенерации, и иммуноокрашенные антителами к CXCR4 и vWF для визуализации образования бластемы. Представительная визуализация цифр, отсканированных до ампутации и в различные временные точки в течение регенерации(рисунок 3A,B) и идентификация ориентиров, используемых для определения измерений длины (рисунок3B) также показано.
Рисунок 1: Цифрирование номера и идентификации взрослой мыши дистальной плоскости ампутации P3. Правая задняя лапа мыши показывается с цифрами, пронумерованными 1-5; ампутации, выполненные в данном исследовании, проводятся на цифрах 2 и 4(A). Дистальная плоскость ампутации P3 показана (пунктированная линия) на цифрах 2 и 4 (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Ранняя интраимбранная окотопительная и бластемная формация в регенерирующей взрослой мыши P3 цифры. Runx2 (зеленый) и PCNA (magenta) двойной иммунофлуоресценции показывают, что распространение остеопрогенитора первоначально локализованы в periosteal и эндостел костных поверхностей на 6 / 7 DPA, и расширить до дистальной бластемы на 9 и 10 DPA(A, E, I). OSX (зеленый) и PCNA (magenta) двойной иммунофлуоресценции показывают несколько OSX-положительных остеобластов и широкое пролиферирование на 6/7 (B), и расширение OSX иммуно-стримингового distally ограничены размножающихся клеток на 9 и 10 DPA (F,J). CXCR4 (красный) иммунофлуоресценции определяет раннее образованиебластемы на 6/7 DPA (C), а затем надежный CXCR4 иммуно-пятно в 9 и 10 DPA регенерирующих цифр (G,K). vWF (зеленый) иммуностоина определяет нетронутые сосуды в костном мозге ампутированных цифр, и несколько положительных клеток, связанных с васкулярной бластемы(D, H, L). Образцы, противоречат DAPI. Дорсал на вершине, дисталь вправо. Бластема, м и мозг. Шкала баров 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Регенерация костей P3, визуализированная последовательным сканированием in-vivo. Представительные визуализации одной цифры, отсканированные до ампутации (неусилит), и по адресу 1, 7, 10, 14, 21 и 28 DPA. Сканирование ЦТ показывает, что регенерация P3 характеризуется первоначальной реакцией гистоза костного мозга, за которой следует формирование костного острована уровне 14 DPA и надежная регенерация костей на 21 и 28 DPA ( A). Репрезентативные рендеры одной цифры, отсканированные до ампутации, и на 1, 7, 10, 14, 21 и 28 DPA, иллюстрирующие области, в которых длина цифр измеряется в каждой временной точке. (B) Зеленые точки указывают на общую измеренную длину, в то время как красный X обозначает область изгнанной кости, исключенной из измерения длины. Отдельные цифровые изображения, созданные ImageJ, могут быть обрезаны для стандартизации размера цифры, чтобы создать изображения, видимые на этой цифре. Дисталь справа, дорсаль на вершину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает стандартизированную процедуру взрослой мыши дистальной ампутации P3, флуоресцентное иммуногистохимическое окрашивание для визуализации и исследования образования бластемы и интраимбранной окостенения, а также последовательное сканирование in-vivo определить костяные морфологические, объемные и длина изменения после ампутации. Ампутация P3 является уникальной, процедурно простой и воспроизводимой моделью для анализа прорегенеративной раневой среды, которая вызывает образование бластемы. Кроме того, модель P3 цифры предлагает многочисленные преимущества по сравнению с традиционными моделями травмы костей для исследования интраимбранной околивания.
Для обеспечения успеха этого протокола необходимо провести полную декальцинацию цифр. В случае, если цифра не полностью декалирована, она будет рушиться и клочья во время процесса секции. Кроме того, тепловой иммуногистохимии может быть проблематичным в том, что ткани могут слегка отделиться или стать полностью выбили из слайда. Чтобы облегчить эту проблему, образцы должны быть установлены на клеевых слайдах с использованием водяной ванны, дополненной гистологическим клеевым агентом, а также выпечки сухих горок до 65 градусов по Цельсию до использования. Наконец, цифры мыши относительно невелики; поэтому для того, чтобы точно визуализировать морфологию и количественно измерить изменения объема и длины костей, ККТ должен иметь достаточное разрешение, чтобы функционировать при соответствующих параметрах сканирования.
Одним из ограничений этого метода является то, что не все первичные антитела совместимы с фиксацией тканей и процессингом парафина. В этом случае, стандартные замороженные ткани криосекционирования может быть выполнена для обеспечения целостности первичного антитела антигена11. Криосекция также устраняет необходимость в шаге декальцинации, однако мы обнаружили, что криосекциация цифр технически более сложная, чем парафинсекционирование.
Вся бластема может быть визуализирована при 10-м увеличении с помощью микроскопии деконволюции, и, используя соответствующее программное обеспечение количественной оценки изображений, результаты иммунодефицита можно легко определить. Флуоресцентная иммуногистохимия зондирования остеогенных маркеров регенерирующей цифры обеспечивает уникальный вид бластремальной дифференциации через интраимбранную окоглазительность. Иммуногистохимическое окрашивание показывает, что реакция на регенерацию костей P3 поляризована и приводит к организованному проксмальному к дистальному образованию костей(рисунок2). На более поздних стадиях регенерации нераспространительные остеобласты, полученные из бластемы, локализуются рядом с костным пнем и дистально ограничены размножающимися остеобластами. Распространяются остеобласты, в свою очередь, дистантно ограничены размножающимися недифференцированными бластемальными клетками. Флуоресцентные иммуногистохимии зондирования для бластемы маркер CXCR4 определяет ранние клетки бластемы, связанные с поврежденной поверхности кости следуют расширенные иммуносохранения на более поздних стадиях регенерации (Рисунок 2). Бластема является васкулярным13 и иммунофлуоресценции для эндотелиального маркера клеток vWF определяет несколько положительных клеток в области бластемы(Рисунок 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим членов лаборатории Muneoka и Техасского института геномной медицины (TIGM). Эта работа была поддержана Техасским университетом А И М.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
References
- Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
- Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).
- Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
- Neufeld, D. A., Zhao, W. Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation. Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).
- Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).
- Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
- Chamberlain, C. S., et al. Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx. Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).
- Dawson, L. A., et al. Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice. Regeneration. 3, 39-51 (2016).
- Seifert, A. W., Muneoka, K. The blastema and epimorphic regeneration in mammals. Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).
- Carlson, B. M. Principles of Regenerative Biology. , Elsevier. Burlington, MA. (2007).
- Fernando, W. A., et al. Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice. Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).
- Simkin, J., et al. Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration. Regeneration. 2, 106-119 (2015).
- Yu, L., et al. Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration. Regeneration. 1, 33-46 (2014).
- Dolan, C. P., et al. Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice. Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).
- Dawson, L. A., et al. Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).
- Sammarco, M. C., et al. Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).
- Einhorn, T. A.
- Shapiro, F. Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts. European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).
- Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine. Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).
- Lee, J., et al. SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2. Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).
- Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47, 1076-1079 (2010).
