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Developmental Biology

वयस्क माउस अंक विच्छेदन और पुनर्जनन: एक सरल मॉडल मैमलियन Blastema गठन और Intramembranous Ossification की जांच करने के लिए

Published: July 12, 2019 doi: 10.3791/59749
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Veterinary Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, 2Department of Veterinary Integrative Biosciences, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, 3Department of Neurosurgery, University of Mississippi Medical Center

Summary

यहाँ, हम वयस्क माउस टर्मिनल phalanx विच्छेदन का एक प्रोटोकॉल पेश करने के लिए स्तनधारी blastema गठन और intramembranous ossification की जांच, फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और अनुक्रमिक में-vivo microcomputed टोमोग्राफी द्वारा विश्लेषण किया.

Abstract

यहाँ, हम वयस्क माउस distal टर्मिनल phalanx (P3) विच्छेदन, एक प्रक्रियात्मक सरल और epimorphic पुनर्जनन के reproducible स्तनधारी मॉडल है, जो blastema गठन और intramembranous ossification द्वारा विश्लेषण शामिल है की एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और अनुक्रमिक इन-विवो माइक्रोकम्प्यूटेड टोमोग्राफी (जेडसीटी)। मैमली पुनर्जनन टर्मिनल phalanx (P3) के distal क्षेत्र transecting विच्छेदन के लिए प्रतिबंधित है; अधिक समीपस्थ स्तर पर विच्छेदन किए गए अंक फाइब्रोटिक उपचार और निशान गठन से गुजरना करने में विफल रहते हैं। पुनर्जनन प्रतिक्रिया एक proliferative blastema के गठन के द्वारा मध्यस्थता की है, इसके बाद हड्डी पुनर्जनन के माध्यम से intrembranous ossification के लिए विच्छेदन कंकाल लंबाई बहाल करने के द्वारा. P3 विच्छेदन स्तनधारियों में epimorphic पुनर्जनन की जांच करने के लिए एक पूर्व नैदानिक मॉडल है, और एक सफल पुनर्योजी प्रतिक्रिया के साथ फाइब्रोटिक चिकित्सा की जगह चिकित्सीय रणनीतियों के डिजाइन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. हमारे प्रोटोकॉल के लिए फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करता है 1) जल्दी और लेट blastema सेल आबादी की पहचान, 2) अध्ययन पुनर्जनन के संदर्भ में revascularization, और 3) जटिल हड्डी के लिए आवश्यकता के बिना intramembranous ossification की जांच स्थिरीकरण उपकरणों. हम विच्छेदन के बाद आकृतिक परिवर्तनों की जांच करने के लिए उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों को बनाने के लिए विवो में अनुक्रमिक के उपयोग के साथ-साथ पुनर्जनन के दौरान एक ही अंक में मात्रा और लंबाई में परिवर्तन भी प्रदर्शित करते हैं। हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल दोनों epimorphic और स्तनधारियों में ऊतक पुनर्योजी प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए जबरदस्त उपयोगिता प्रदान करता है.

Introduction

मानव और चूहों सहित स्तन, टर्मिनल phalanx (P3)1,2,3के विच्छेदन के बाद अपने अंकों के सुझावों को पुनर्जीवित करने की क्षमता है। चूहों में, पुनर्जनन प्रतिक्रिया विच्छेदन स्तर पर निर्भर है; तेजी से समीपस्थ अंक विच्छेदन एक उत्तरोत्तर क्षीण पुनर्योजी प्रतिक्रिया प्रदर्शित जब तक विच्छेदन transecting पर पूर्ण पुनर्योजी विफलता और P3 नाखून मैट्रिक्स4,5,6 के लिए निकट , 7 , 8. च3 पुनर्जनन एक ब्लास्टेमा के गठन से मध्यस्थता की जाती है, जिसे अपादान कोशिकाओं की जनसंख्या के रूप में परिभाषित किया जाता है जो विच्छेदनसंरचनाओं को पुनर्जीवित करने के लिए रूपजनन से गुजरती हैं9. विच्छेदन से खो संरचनाओं को पुनर्जीवित करने के लिए एक blastema के गठन, एक प्रक्रिया epimorphic पुनर्जनन कहा जाता है, चोट6के बाद पारंपरिक ऊतक की मरम्मत से बहु ऊतक स्तर पी 3 पुनर्जनन प्रतिक्रिया भेद, 10पी 3 पुनर्जनन एक पुनरुज्जीवन है जो घाव भरने वाले11,12, हड्डी हिस्टोलिसिस11,12, सहित जटिल पुनर्योजी प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए एक पुनरुत्पादक और प्रक्रियात्मक सरल मॉडल है , पुनर्संवक्षण13, परिधीय तंत्रिका पुनर्जनन14, और ब्लास्टेमल रूपांतरण अस्थि के माध्यम से अंतर्विष् ट अस्थि 15 .

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करने वाले पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ब्लास्टेमा विषमांगी , अवास्कुलर , हाइपोक्सिक और अत्यधिक प्रसारी11,13,15,16है . दूरस्थ पी 3 विच्छेदन के बाद, जल्दी blastema शुरू में P3 periosteum और endosteum के साथ जुड़ा हुआ है और मजबूत प्रसार और हड्डी की सतह15के निकट नवजात अस्थिजनन की विशेषता है. हड्डी गिरावट और घाव बंद करने के बाद, विषम ब्लास्टेमा पेरिओस्टल और एंडोस्टील-संबद्ध कोशिकाओं के विलय से बनता है, इसके बाद अंतर्जातीय अस्थि के माध्यम से हड्डी सहित ब्लास्टेमल घटकों के विभेदन के बाद 15.

चोट के जवाब में हड्डी की मरम्मत आम तौर पर endochondral ossification द्वारा होता है, यानी एक प्रारंभिक उपास्थि कॉलस के माध्यम से कि बाद में हड्डी गठन के लिए एक टेम्पलेट रूपों17,18. लंबी हड्डी intramembranous ossification, अर्थात्, एक उपास्थि मध्यवर्ती बिना हड्डी गठन, आमतौर पर जटिल व्याकुलता उपकरणों या शल्य निर्धारण का उपयोग कर प्रेरित है19,20. अंक पुनर्जनन प्रतिक्रिया एक पूर्व नैदानिक मॉडल है कि पारंपरिक intramembranous ossification मॉडल पर लाभ प्रदान करता है: 1) यह बाहरी या आंतरिक निर्धारण पोस्ट चोट की आवश्यकता नहीं है intramembranous ossification को प्रोत्साहित करने के लिए, 2) यह है प्रत्येक जानवर से 4 अंक का उपयोग कर प्रदर्शन किया, इस प्रकार नमूनों को अधिकतम करते हुए पशु उपयोग को कम करने, और 3) विवो microcomputed टोमोग्राफी में अनुक्रमिक (जेडसीटी) विश्लेषण आसानी और गति के साथ किया जा सकता है।

वर्तमान अध्ययन में, हम मानकीकृत P3 विच्छेदन विमान दिखाने के लिए एक reproduible और मजबूत पुनर्जनन प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए. इसके अतिरिक्त, हम ब्लास्टेमा गठन की कल्पना करने के लिए पैराफिन वर्गों का उपयोग करके एक अनुकूलित फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं, पुनर्जनन के संदर्भ में पुनर्संवहनीकरण, और अंतर्जातीय के माध्यम से हड्डी में ब्लास्टेमल रूपांतरण अस्थिकरण. हम भी पुनर्जनन के पाठ्यक्रम पर एक ही अंक में हड्डी आकृति विज्ञान, मात्रा, और लंबाई में परिवर्तन की पहचान करने के लिए अनुक्रमिक में विवो जेडसीटी का उपयोग प्रदर्शित करता है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य विच्छेदन के बाद स्तनधारी blastema गठन की जांच करने के लिए और 2 तकनीकों, फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और विवो जेडसीटी में अनुक्रमिक प्रदर्शन करने के लिए है, intramembranous हड्डी पुनर्जनन के अध्ययन के लिए.

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Protocol

सभी पशु उपयोग और तकनीक संस्थागत पशु देखभाल और टेक्सास ए एंड एम विश्वविद्यालय के उपयोग समिति के मानक संचालन प्रक्रियाओं के अनुपालन में थे.

1. वयस्क माउस हिंद अंग जिला P3 विच्छेदन

  1. ऑक्सीजन में isoflurane गैस का उपयोग कर एक 8 से 12 सप्ताह पुराने सीडी-1 माउस (सामग्री की तालिका) एनेस्थेटाइज़; शुरू में एक कक्ष में 3% पर एनेस्थेटाइज, सर्जरी की अवधि में एक नाककोन द्वारा आपूर्ति की 2% isoflurane के बाद। संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर नेत्र मरहम लागू करें।
    नोट: वयस्क P3 विच्छेदन अध्ययन हमारी प्रयोगशाला में मानकीकृत 8 से 12 सप्ताह पुराने चूहों पर प्रदर्शन कर रहे हैं, और पुनर्जनन प्रतिक्रिया सभी परीक्षण उपभेदों में संरक्षित है.
  2. एक 10x विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, शल्य Povidone-आयोडीन और 70% इथेनॉल के साथ पिछले अंग के अंक बाँझ. माइक्रो-स्कर्स का उपयोग करके शल्य चिकित्सा साइट से बाल दूर ट्रिम करें। शल्य साइट anesthetize करने के लिए स्थानीय रूप से सामयिक Bupivacaine के 1 $L लागू करें।
  3. प्रत्येक पिछले अंग के अंक 2 और 4 पर टर्मिनल फैलांक्स (पी 3) के दूरस्थ सिरे को एक बाँझ #10 स्केलपेल का उपयोग करके मिला दिया गया है (चित्र 1क) । विच्छेदन aseptic शर्तों के तहत किया जाना चाहिए, शल्य चिकित्सा उपकरणों की नसबंदी सहित. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, धीरे मध्य अंक की सतह को बेनकाब करने के लिए पिछले पंजा splay. चित्र 1खमें दर्शाए गए विच्छेदन को करने के लिए स्कैल्पल को वसापद के समांतर कोण पर रखें। विच्छेदन साइट पर सामयिक Bupivacaine के 1 $L लागू करें.
    नोट: विच्छेदन नाखून अंग, डर्मिस, पी 3 हड्डी, vasculature, और नसों transects, लेकिन मज्जा गुहा या अंक वसा पैड transect नहीं करता है. यदि खून बह रहा है मनाया जाता है, एक बाँझ कपास टिप applicator का उपयोग कर प्रत्यक्ष दबाव लागू होते हैं.
  4. मानक P3 distal विच्छेदन विमान P3 हड्डी की मात्रा21के लगभग 15%-20% को हटा. MicroCT स्कैनिंग (नीचे देखें) सही विच्छेदन लंबाई की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है.
  5. माउस को एक साफ पिंजरे में वापस करें और घाव को घाव ड्रेसिंग के बिना ठीक करने की अनुमति दें। सामान्य गतिविधि के लिए माउस रिटर्न सुनिश्चित करने के लिए 3 दिनों के लिए माउस की निगरानी करें।

2. अंक संग्रह और ऊतक तैयारी

  1. एक बंद कक्ष में कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) का उपयोग कर के माउस Euthanize, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद.
  2. आसन्न हड्डी खंड के माध्यम से अंक मध्य मार्ग को तोड़ने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें, मध्य phalanx (P2) हड्डी, लगभग दूसरे अधर वसा पैड इंडेंट पर. अंक (ओं) को 20 एमएल स्सिंटिलेशन शीशी में स्थानांतरित करें जिसमें 10 एमएल ताजा बफर्ड जस्ता फॉर्मेलिन फिक्सेटिव, एक 18% फार्मेल्डिहाइड समाधान (सामग्री की तालिकादेखें)। फिक्सेटिव वॉल्यूम मौजूद ऊतक की मात्रा में कम से कम 20x होना चाहिए।
    नोट: अंक विच्छेदन के बाद विभिन्न timepoints पर एकत्र कर रहे हैं पूर्ण पुनर्जनन प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए. आम तौर पर, जल्दी blastema गठन के लिए, हड्डी हिस्टोलिसिस, और घाव बंद संग्रह timepoints 4-8 दिन विच्छेदन के बाद (डीपीए) कर रहे हैं. जल्दी ऑस्टियोजेनिक blastema की जांच करने के लिए संग्रह timepoints 9 और 10 DPA हैं, और जारी हड्डी पुनर्जनन और खनिजीकरण कल्पना करने के लिए, संग्रह timepoints 14, 21, और 28 DPA हैं. Unamputated अंक के रूप में अच्छी तरह से एकत्र कर रहे हैं.
  3. एक शेकर पर कोमल मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर 24-48 एच के लिए अंक को ठीक करें।
  4. स्थिर निकालें और कमरे के तापमान पर 1x फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के 5 एमएल में 5 मिनट के लिए अंक 2x धो लें।
  5. ताजा Decalcifier I के 10 एमएल प्लेस (सामग्री की तालिकादेखें), एक 10% formic एसिड समाधान, scintillation शीशी में और धीरे कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए एक शेकर पर मिश्रण. 2 ज के बाद, ताजा समाधान के साथ Decalcifier मैं की जगह और शेकर पर कोमल मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर रात भर decalcify अंक।
  6. Decalcifier मैं निकालें और कमरे के तापमान पर 1x PBS के 5 एमएल में 5 मिनट के लिए अंक 2x धो लो.
  7. एक वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला के माध्यम से अंक की प्रक्रिया। इस प्रक्रिया को मैन्युअल रूप से एक 20 एमएल scintillation शीशी में किया जा सकता है, प्रत्येक तरल के 10 एमएल का उपयोग कर अगर कम से कम 40 कुल अंक.
    1. एक शेकर पर कोमल मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर ताजा 70% इथेनॉल में 2 विसर्जन के साथ शुरू, 1 एच प्रत्येक, एक शेकर पर कोमल मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर ताजा 95% इथेनॉल में 2 विसर्जन के बाद, 1 एच प्रत्येक.
    2. एक शेकर पर कोमल मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर ताजा 100% इथेनॉल के 2 washes के साथ अंक निर्जलीकरण को पूरा करें, 1 एच प्रत्येक. अंतिम 100% इथेनॉल धोने रात भर छोड़ा जा सकता है.
  8. एक ही scintillation शीशी में, ताजा xylenes के 10 एमएल के साथ 10% इथेनॉल की जगह है, और कमरे के तापमान पर 1.5 एच के लिए एक रासायनिक धूआं हुड में शीशी जगह है। 2 washes की कुल के लिए कमरे के तापमान पर 1.5 एच के लिए एक रासायनिक धूआं हुड में xylenes की एक ताजा धोने के साथ दोहराएँ.
  9. तरल पैराफिन मोम के साथ xylenes बदलें 68 डिग्री सेल्सियस के लिए पिघल, और 2 एच, 2 बार के लिए 68 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में शीशी जगह है। पैराफिन मोम में विसर्जन के 4 कुल एच के बाद, पैराफिन सेक्शनिंग के लिए अंक एम्बेड करें।
    नोट: ऊतक विज्ञान के लिए अंक प्रसंस्करण एक स्वचालित प्रोसेसर में किया जा सकता है, इन एक ही दिशा निर्देशों का पालन.
  10. एक microtome का उपयोग कर 4-5 डिग्री मीटर मोटाई पर धारा अंक. चिपकने वाला स्लाइड पर अनुभागीय नमूने रखें, एक 38-41 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान का उपयोग कर एक हिस्टोलॉजिकल चिपकने वाला समाधान के साथ पूरक नमूने स्लाइड का पालन सुनिश्चित करने के लिए। सूखी करने के लिए गर्म 37 डिग्री सेल्सियस स्लाइड पर स्लाइड रखें।

3. इम्यूनोहिस्टोकेमिकल वयस्क माउस अंकों के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल दाग ब्लास्टेमा गठन और इंट्रामेब्रेशन की जांच करने के लिए

  1. 45 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर हीट अनुभागीय स्लाइड, कम से कम 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग के बाद यह सुनिश्चित करने के लिए नमूने स्लाइड का पालन करें।
  2. Deparaffinize और rehydrate स्लाइड 2x xylenes के 5 मिनट washes, एक वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला, और पानी में डूब के साथ. एक 50-100 एमएल क्षमता धुंधला जार में स्लाइड प्लेस और Tween 20 (TBST) के साथ 1x Tris बफर Saline में डूबे रहते हैं.
    नोट: दाग लगाने की प्रक्रिया के दौरान नमूनों को सूखने की अनुमति न दें। किसी भी TBST चरण में, स्लाइड्स को 2 h तक इनक्यूबेट किया जा सकता है।
  3. एक humidifying कक्ष तैयार करें. आधार पर गीला ऊतक कागज के साथ एक 1-इंच गहरी कवर प्लास्टिक स्लाइड बॉक्स पर्याप्त है।
  4. Runx2, Osterix (OSX) के लिए गर्मी पुनर्प्राप्ति समाधान तैयार करें, और सेल न्यूक्लियर एंटीजन (PCNA) का प्रसार करें। जल्दी ऑस्टियोप्रोजेनेटर मार्कर के प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के लिए, Runx2, Tris-EDTA, पीएच 8 के एक 1x समाधान तैयार करते हैं। ऑस्टियोब्लास्ट मार्कर, OSX के लिए, साइट्रेट बफर, पीएच 6 का 1x समाधान तैयार करें। PCNA इम्यूनोस्टेनिंग या तो समाधान में किया जा सकता है।
  5. ब्लास्टेमा मार्कर CXCR422 और एंडोथेलियल सेल मार्कर वॉन विलेब्रांड फैक्टर 8 (vWF) के लिए प्रोटीनेज के एंटीजन रिट्रीवल समाधान तैयार करें, एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्रति स्लाइड प्रोटीनेज के 100 $L को रखकर और 37 डिग्री सेल्सियस (लगभग) को गर्म करना 5 मि)।
    नोट: Runx2 के लिए Antigen पुनर्प्राप्ति, OSX, और PCNA गर्मी पुनर्प्राप्ति का उपयोग कर किया जाता है, और CXCR4 और vWF प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रोटीनकेके उपचार के माध्यम से किया जाता है.
  6. गर्मी की आवश्यकता होती एंटीबॉडी पुनर्प्राप्ति के लिए, उपयुक्त प्रतिजन पुनर्प्राप्ति समाधान में एक धुंधला जार में स्लाइड विसर्जित. 25 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी स्लाइड, यह सुनिश्चित करने के उबलते नहीं होता है. गर्मी स्रोत से धुंधला जार निकालें और 35 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं।
  7. प्रोटीनाज के एंटीजन रिट्रीवल के लिए, humidifying कक्ष में फ्लैट स्लाइड करना, और स्लाइड पर पूर्व-वार्म्ड प्रोटीने के 100 डिग्री सेल्सियस रखें। स्लाइड सूखी नहीं बनने के लिए सुनिश्चित करने के लिए पैराफिल्म की एक छोटी पट्टी के साथ स्लाइड कवर। 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 मिनट के लिए इनक्यूबेट स्लाइड।
  8. एंटीजन रिट्रीवल के बाद धुंधला जार में 1x TBST में 5 मिनट के लिए 3 बार स्लाइड धोएं।
  9. धुंधला जार से स्लाइड निकालें और humidifying कक्ष में जगह है. स्लाइड पर समाधान (सामग्रीकीतालिका) को अवरोधित करने की 6-7 बूँदें रखें, और स्लाइड शुष्क न होने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए ताजा पैराफिन फिल्म के साथ स्लाइड को कवर करें। कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट स्लाइड।
  10. एंटीबॉडी को एंटीबॉडी में कम करके प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें (सामग्री की तालिका) . भंवर प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के लिए 3 s. विभिन्न मेजबान प्रजातियों से व्युत्पन्न प्राथमिक एंटीबॉडी संयुक्त किया जा सकता है.
    नोट: Runx2 के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला (रैबिट एंटी-Runx2 एंटीबॉडी, 1:250 कमजोर पड़ने, की एक अंतिम एकाग्रता पर 4 g/mL) PCNA के साथ संयुक्त (मोनोक्लोनल माउस विरोधी PCNA एंटीबॉडी, 1:2,000 तनुता, की एक अंतिम एकाग्रता पर 0.5g/mL), और OSX (रैबिट एंटी-OSX एंटीबॉडी, 1:400 तनुकरण, पीसीएनए के साथ संयुक्त 0.125 ग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता में चित्र 2में दिखाया गया है। माउस विरोधी PCNA एंटीबॉडी इस अध्ययन में इस्तेमाल किया अत्यधिक विशिष्ट है और इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित उन से परे कोई अतिरिक्त अवरुद्ध कदम की आवश्यकता है. CXCR4 का उपयोग कर Immunohistochemical दाग (रैट विरोधी CXCR4 एंटीबॉडी, 1:500 2 g/mL) और vWF (रैबिट विरोधी मानव vWF VIII एंटीबॉडी, 1:800 कमजोर पड़ने की एक अंतिम एकाग्रता में चित्रा 2में दिखाया गया है. प्राथमिक एंटीबॉडी को इस प्रोटोकॉल में शर्तों के तहत हमारी प्रयोगशाला द्वारा अनुकूलित और परीक्षण किया गया था और सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध किया गया है .
  11. ध्यान से पैराफिन फिल्म को हटा दें, और धीरे से अतिरिक्त अवरुद्ध समाधान को दूर करने के लिए ऊतक कागज पर स्लाइड नाली। स्लाइड पर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 100-200 डिग्री सेल्सियस रखें, पैराफिल्म कवर की जगह, और humidifying कक्ष में लौटने. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर बंद humidifying कक्ष में स्लाइड इनक्यूबेट करें।
    नोट: अवरुद्ध समाधान draining जबकि स्लाइड सूखी हो मत करो. यह चरण शीघ्रता से किया जाता है।
  12. पैराफिल्म को सावधानीपूर्वक निकालें, और स्लाइड से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को धीरे से निकालें। ताजा 1X TBST युक्त एक धुंधला जार में स्लाइड प्लेस. 5 मिनट 3 बार के लिए ताजा 1x TBST के साथ धो लें.
  13. द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ संयोजन करके द्वितीयक एंटीबॉडी तैयार करें (सामग्री की सारणी)। भंवर 3 एस के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान. विभिन्न प्रजातियों से व्युत्पन्न विभिन्न फ्लोरोफोर्स के लिए कंजूज माध्यमिक एंटीबॉडी संयुक्त किया जा सकता है।
    नोट: फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी हल्के संवेदनशील होते हैं। Alexa Fluor 488-संयुग्मी बकरी विरोधी rabbit IgG (एच + एल) Runx2 के लिए, OSX, और vWF, Alexa Fluor 568-संयोजित बकरी विरोधी रैट IgG (एच + एल) CXCR4 के लिए, और Alexa Fluor 647-संयुग्मी बकरी विरोधी mouse IgG (एच + एल) के लिए 1:50 पर पतला 4/ , चित्र 2में इस्तेमाल किया गया .
  14. स्लाइड पर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 200 डिग्री सेल्सियस रखें, ताजा पैराफिन फिल्म के साथ स्लाइड को कवर करें, और humidifying कक्ष में वापस जाएँ। कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए बंद humidifying कक्ष में स्लाइड इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि humidifying कक्ष प्रकाश से बचने के लिए बंद कर दिया है.
  15. ध्यान से पैराफिन फिल्म को हटा दें और धीरे से स्लाइड से माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान नाली. ताजा 1x TBST युक्त एक धुंधला जार में स्लाइड प्लेस. 5 मिनट 3x के लिए ताजा 1x TBST के साथ धो लें. प्रकाश से बचें।
  16. परमाणु दाग तैयार करें। डीएपीआई के 20 डिग्री एल (स्टॉक डीएपीआई समाधान एच2ओ में 5 मिलीग्राम/एमएल है) को 1x पीबीएस के 200 एमएल में जोड़ें और एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए जोरदार हिलाएं। DAPI-PBS समाधान में 5 मिनट के लिए स्लाइड विसर्जित करें। प्रकाश से बचें।
  17. 3 मिनट के लिए dH2O में स्लाइड को धोएं और स्लाइड को हवा में सुखालें या धीरे से स्लाइड से पानी को जल्दी करने दें, यह सुनिश्चित करें कि नमूने वैक्यूम करते समय परेशान न हों। प्रकाश से बचें।
  18. ध्यान से कवर पर्ची सूखी स्लाइड विरोधी फीका बढ़ते माध्यम के 100 डिग्री सेल्सियस का उपयोग कर (सामग्री की तालिका); बढ़ते कदम के दौरान स्लाइड पर हवा के बुलबुले के गठन से बचें। स्लाइड फ्लैट स्टोर और बढ़ते माध्यम एक प्रकाश प्रूफ कंटेनर में कमरे के तापमान पर रात भर सुखाने के लिए अनुमति देते हैं। बढ़ते माध्यम शुष्क होने के बाद, देखने के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस में हल्के प्रूफ कंटेनर में फ्लैट स्लाइड की दुकान करें।
    नोट: हवा के बुलबुले के अस्वीकार्य स्तर बढ़ते के बाद मौजूद हैं, घुड़सवार स्लाइड धीरे 1x पीबीएस में रखा जा सकता है, coverslip हटाया जा सकता है, और एक बार स्लाइड पानी में फिर से कुल्ला है और फिर से सूखा है, फिर से घुड़सवार किया जा सकता है।

4. माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण

नोट: इमेजिंग और विश्लेषण एक फ्लोरोसेंट deconvolution माइक्रोस्कोप और जुड़े सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, 3 फ्लोरोसेंट फिल्टर के साथ सुसज्जित (एलेक्सा फ्लोर 488, 568, और 647 एनएम संकेतों कल्पना करने के लिए), प्लस DAPI (419 एनएम) इस प्रयोग में प्रयोग किया जाता है.

  1. पूरे blastema क्षेत्र पर कब्जा करने के लिए 10x आवर्धन पर स्लाइड छवि.
    नोट: ऑस्टियोब्लास्ट प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने का प्रसार माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करता है (एलेक्सा फ्लोर 488 और 647) गैर overlapping उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ सह लेबल कोशिकाओं की गलत पहचान को कम करने के लिए. autofluorescent संकेत की पृष्ठभूमि घटाव 488 या 647 संकेतों की अखंडता सुनिश्चित करने के लिए 568 एनएम फिल्टर का उपयोग किया जा सकता है। Blastema प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने माध्यमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल करता है (एलेक्सा फ्लोर 488 या 568). autofluorescent संकेत की पृष्ठभूमि घटाव 568 फिल्टर के साथ किया जा सकता है अगर 488-कन्जुएट एंटीबॉडी का उपयोग कर, और 488 फिल्टर 568-संयोजित एंटीबॉडी का उपयोग कर रहा है. Autofluorescent संकेत आम तौर पर अंक भर में नाखून प्लेट और एरिथ्रोसाइट्स के साथ जुड़ा हुआ है, और 488, 568, और 647 फिल्टर में मनाया जाता है।

5. विवो माइक्रोकम्प्यूटेड टॉमोग्राफी (जेडसीटी) में अनुक्रमिक

  1. विच्छेदन से पहले 1 दिन में स्कैन किए गए एक ही जानवर के अंकों को पुन: उत्पन्न करना (अनिवार्य), 1 डीपीए, और विभिन्न समय बिंदुओं पर जब तक 28 डीपीए में पूर्ण पुनर्जनन तक vivaCT 40 (सामग्री की तालिका) इस प्रयोग में किया जाता है और में दिखाया जाता है चित्र 3A|
  2. ट्यूबिंग के साथ $CT को फिट करने के लिए जेडसीटी पशु कक्ष में और बाहर ऑक्सीजन का प्रवाह सक्षम करने के लिए, यह सुनिश्चित करना कि बाहर बह ने ऑक्सीजन एक सक्रिय चारकोल फिल्टर से सुसज्जित है isoflurane जाल.
    नोट: सुनिश्चित करें कि [सीटी पशु कक्ष कसकर संलग्न है; इस तरह, स्कैन के दौरान माउस को isoflurane की आपूर्ति के लिए एक पशु नाक-कोन की आवश्यकता नहीं है।
  3. $CT स्कैनिंग पैरामीटर तैयार करें। अंक 10.5 डिग्री के एक voxel आकार पर स्कैन कर रहे हैं, 55 kVp पर, 145 uA प्रति 1000 अनुमानों के साथ 180 डिग्री निरंतर रोटेशन का उपयोग कर, और 200 msec के एक एकीकरण समय के साथ, स्कैन प्रति 213 स्लाइस की एक अधिकतम में जिसके परिणामस्वरूप. इस प्रयोग में किए गए स्कैन लगभग 9 मिनट लंबे होते हैं। एक घटी हुई बिजली की धारा आनुपातिक वृद्धि एकीकरण समय के साथ मुआवजा दिया जा सकता है, लेकिन अब स्कैन समय में परिणाम होगा.
  4. isoflurane का उपयोग कर वयस्क माउस एनेस्थेटाइज़; शुरू में एक कक्ष में 3% पर anesthetize, इसके बाद 1.5% isoflurane स्कैन की अवधि में $CT पशु कक्ष के लिए आपूर्ति की. धीरे से स्कैनिंग मंच पर बाईं ओर बाएं पंजा और दाईं ओर दाएँ पंजा के साथ बंद सहयोग में व्यवस्था की hindlimb अंकों के साथ जेडसीटी पशु कक्ष में माउस जगह, धीरे शल्य चिकित्सा का उपयोग कर जगह में अंक हासिल करने के बाद टेप. संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर नेत्र मरहम लागू करें।
  5. एक साफ पिंजरे के लिए माउस लौटें और जाग जब तक माउस की निगरानी. पूरे हड्डी पुनर्जनन प्रतिक्रिया कल्पना करने के लिए द्वि-साप्ताहिक साप्ताहिक समय अंक पर एक ही माउस स्कैनिंग जारी रखें।
  6. स्कैनकरने के बाद, होने के लिए कई घंटे तक की अनुमति दें. $CT के साथ प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करना, फ़ाइलों को dicom फ़ाइलों की एक श्रृंखला में कनवर्ट करें; प्रत्येक dicom फ़ाइल स्कैन का एक टुकड़ा करने के लिए संगत होगा, इसलिए, अगर 213 स्लाइस स्कैन किया गया है, 213 dicom फ़ाइलें उत्पन्न और कंपनी के सर्वर पर अपलोड किया जाएगा.
  7. किसी वेब ब्राउज़र में बैच फ़ाइल डाउनलोडर का उपयोग करके किसी एकल फ़ोल्डर में dicom श्रृंखला डाउनलोड करें।
  8. BoneJ प्लगइन23 डाउनलोड करें और ImageJ प्लगइन फ़ोल्डर में फ़ाइल खींचें. ImageJ में, खींच कर और ImageJ पट्टी करने के लिए फ़ोल्डर छोड़ने के द्वारा एक ढेर के रूप में dicom फ़ाइल श्रृंखला खोलें. सभी धूसर मानों को प्रदर्शित करने वाला 16-बिट छवि स्टैक खोला जाएगा. केवल हड्डी प्रदर्शित करने केलिए, छवि थ्रेशोल्ड प्रदर्शन (मैंदाना और समायोजित करें ]gt; थ्रेशहोल्ड).
    नोट: ImageJ फ़ाइलों को देखते समय, ImageJ आउटपुट अंकों की एक उलटा छवि के अनुरूप होगा; यानी, स्कैनिंग मंच अधर पक्ष में व्यवस्था अंक, मंच के बाईं ओर और मंच के दाईं ओर सही पंजा के साथ, पृष्ठीय पक्ष अप के रूप में दिखाई देगा, बाईं ओर सही पंजा और ImageJ छवि ढेर के दाईं ओर छोड़ दिया पंजा.
  9. एक बार थ्रेशोल्ड संवाद बॉक्स खोला है, नीचे पट्टी स्लाइड, ऊपरी थ्रेशोल्ड के लिए इसी, दूर सही करने के लिए, और शीर्ष पट्टी समायोजित, निचले थ्रेशोल्ड के लिए इसी, जब तक केवल हड्डी लाल प्रकाश डाला है. निम्न सीमा मान 32,767 की अधिकतम सिग्नल तीव्रता पर लगभग 10,000-13,000 होगा. लागूकरें क्लिक करें, और नए संवाद बॉक्स में काली पृष्ठभूमिपर क्लिक करें. ठीकक्लिक करें.
  10. एक 8 बिट छवि काले और सफेद मूल्यों को प्रदर्शित करने के लिए सफेद हड्डी के लिए इसी के साथ उत्पन्न किया जाएगा. इसके चारों ओर एक आयत ड्राइंग द्वारा P3 हड्डी का चयन करें, और ढेर डुप्लिकेट. एक 3 डी छवि उत्पन्न(Plugins और 3 डीदर्शक). छवि से किसी भी अनावश्यक हड्डी फसल के लिए, मुक्तहस्त चयन उपकरण पर क्लिक करें, और हड्डी चक्र नष्ट किया जा करने के लिए। राइट क्लिक करें, और हड्डी को हटाने के लिए चयन भरें का चयन करें का चयन करें।
    नोट: ऊपर वर्णित चरण ImageJ 1.52h, Java 8 पर लागू होते हैं और ImageJ के किसी भिन्न संस्करण का उपयोग करते समय थोड़ा भिन्न हो सकते हैं. देहली के लिए, हम एक इष्टतम मूल्य के निर्धारण और लगातार उस मूल्य का उपयोग करने की सलाह देते हैं.
  11. BoneJ वॉल्यूम अंश प्लगइन का उपयोग करके 3 D प्रतिपादन से अस्थि मात्रा मात्रा(Plugins और BoneJ gt; वॉल्यूम भिन्न)। एक परिणाम विंडो दिखाई देगा, और हड्डी की मात्रा (बीवी) मिमी3में प्रदर्शित किया जाएगा.
  12. ImageJ multipoint उपकरण का उपयोग करके 3 डी प्रतिपादन से हड्डी की लंबाई मात्रा.
    नोट: हड्डी की लंबाई P3 पुनर्जनन के पाठ्यक्रम पर गतिशील है; अस्थिखंड-मध्यस्थ अस्थि अवक्रमण11के साथ संबद्ध 7-10 डीपीए के बीच लंबाई कम हो जाती है, और इसके बाद 14-28 डीपीए (चित्र 3 बी) के बीच दूरस्थ अस्थि पुनरुत्तरता की अवधि के बाद होता है। लंबाई को पी 2/पी 3 संयुक्त के केंद्रीय आधार से दूरस्थ हड्डी शीर्ष पर खनिजीकरण के सबसे दूर बिंदु तक मापा जाता है, लेकिन इसमें निम्नीकृत अस्थि शामिल नहीं होती है जिसे पूरी तरह से अलग कर दिया गया है (चित्र 3 ख)। BoneJ हड्डी वास्तुकला का पूरा 3 डी मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है; इस प्रकार, जिस कोण में हड्डी को स्कैन किया जाता है, वह लंबाई को मापने की क्षमता में परिवर्तन नहीं करेगा।
  13. दृश्यक्लिक करके 3D रेंडरिंग की छवि कैप्चर करें, और स्नैपशॉट लें. छवि को एक tIF या जेपीईजी फ़ाइल के रूप में सहेजें।

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Representative Results

6/7 DPA पर वयस्क माउस regenerating P3 अंक (चित्र 2A-D), 9 DPA (चित्र 2E-H), और 10 DPA (चित्र 2I-L) Runx2, OSX, और PCNA के लिए एंटीबॉडी के साथ प्रतिरक्षा किया गया था intramembranous हड्डी कल्पना करने के लिए पुनर्जनन, और CXCR4 और vWF के लिए एंटीबॉडी के साथ प्रतिरक्षा blastema गठन कल्पना करने के लिए. विच्छेदन से पहले और पुनर्जनन के दौरान विभिन्न समय ों पर स्कैन किए गए अंकों के प्रतिनिधि (चित्र 3ए, ख) और लंबाई मापन की पहचान करने के लिए उपयोग किए गए स्थलों की पहचान ( चित्र 3ख) भी दिखाया गया है.

Figure 1
चित्र 1: अंक संख्या और वयस्क माउस distal P3 विच्छेदन विमान की पहचान. वयस्क माउस दाएँ पिछला पंजा अंकों के साथ दिखाया गया है 1-5 गिने; इस अध्ययन में किए गए विच्छेदन अंक 2 और 4 (ए) पर किए जाते हैं । जिला च3 विच्छेदन तल अंक 2 और 4 (बी ) परदिखाया गया है । कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रारंभिक intramembranous ossification और regenerating वयस्क माउस P3 अंक में blastema गठन. Runx2 (हरा) और PCNA (magenta) डबल इम्यूनोफ्लूओरेसेंससेंस से पता चलता है कि ऑस्टियोप्रोजेनेटरों को शुरू में 6/7 डीपीए में पेरिओस्टल और एंडोस्टील हड्डी सतहों के लिए स्थानीयकृत किया जाता है, और 9 और 10 डीपीए(ए, ई, आई) पर डिस्टेटल ब्लास्टेमा का विस्तार होता है। OSX (हरा) और PCNA (magenta) डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस कुछ OSX-सकारात्मक ऑस्टियोब्लास्ट्स और 6/7(बी) पर व्यापक प्रसार दिखाते हैं , और बढ़ाया OSX इम्यूनोस्टेनिंग distallying 9 और 10 डीपीए (एफ,जे) पर कोशिकाओं को बढ़ाने से घिरा हुआ है। CXCR4 (लाल) इम्यूनोफ्लोरेसेंस 6/7 डीपीए (सी) पर जल्दी ब्लास्टेमा गठन की पहचान करता है , इसके बाद 9 और 10 डीपीए रीजेनेटिंग अंक (जी,के) में मजबूत CXCR4 इम्यूनोस्टेनिंग होता है। vWF (हरा) इम्यूनोस्टेनिंग विच्छेदन अंक की मज्जा में बरकरार vasculature की पहचान करता है, और avascular blastema के साथ जुड़े कुछ सकारात्मक कोशिकाओं(डी, एच, एल). DAPI के साथ काउंटर किए गए नमूने। डोर्सल शीर्ष पर है, दूर सही करने के लिए है। ब्लाउ ब्लास्टेमा, मी ] मज्जा। स्केल बार्स ] 100 $m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: P3 हड्डी पुनर्जनन अनुक्रमिक द्वारा कल्पना में vivo ]CT स्कैनिंग. विच्छेदन (unamp) से पहले स्कैन किए गए एक अंक के प्रतिनिधि ]CT प्रतिपादन, और 1, 7, 10, 14, 21, और 28 DPA पर. [सीटी स्कैनिंग पी 3 पुनर्जनन को दर्शाता है एक प्रारंभिक हड्डी हिस्टोलिसिस प्रतिक्रिया द्वारा विशेषता है, 14 DPAपर हड्डी द्वीप गठन और 21 और 28 डीपीए (ए) में मजबूत हड्डी पुनर्जनन के बाद. विच्छेदन से पहले और 1, 7, 10, 14, 21 और 28 डीपीए में स्कैन किए गए एक अंक के प्रतिनिधि ]CT प्रतिपादन उन क्षेत्रों का चित्रण करते हैं जिनमें प्रत्येक समय बिंदु पर अंक लंबाई मापी जाती है। (ठ) ग्रीन डॉट्स मापा कुल लंबाई का संकेत है, जबकि लाल एक्स लंबाई माप से बाहर रखा निष्कासित हड्डी के क्षेत्र को दर्शाता है. ImageJ द्वारा बनाई गई अलग-अलग अंक छवियों को इस आंकड़े में देखा छवियों के निर्माण को सक्षम करने के लिए अंक आकार मानकीकृत करने के लिए फसली जा सकता है। Distal सही करने के लिए है, पृष्ठीय शीर्ष करने के लिए है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल वयस्क माउस distal P3 विच्छेदन की एक मानकीकृत प्रक्रिया का वर्णन करता है, फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला कल्पना और blastema गठन और intramembranous ossification की जांच करने के लिए, और अनुक्रमिक में-vivo ]CT स्कैनिंग करने के लिए हड्डी आकृतिक, मात्रा, और लंबाई परिवर्तन के बाद विच्छेदन की पहचान. P3 विच्छेदन एक अद्वितीय, procedurally सरल, और reproduible मॉडल एक समर्थक regenerative घाव वातावरण है कि blastema गठन से चलाता है का विश्लेषण करने के लिए है. इसके अलावा, P3 अंकमॉडल पारंपरिक हड्डी चोट मॉडल पर कई फायदे प्रदान करता है intramembranous ossification की जांच.

इस प्रोटोकॉल की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, पूर्ण अंक decalcification किया जाना चाहिए। अगर अंक पूरी तरह से decalcified नहीं है, यह काट प्रक्रिया के दौरान उखड़ जाएगा और टुकड़ा. इसके अतिरिक्त, गर्मी पुनर्प्राप्ति इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री में समस्याग्रस्त हो सकता है कि ऊतक थोड़ा अलग हो सकते हैं या स्लाइड से पूरी तरह से अलग हो सकते हैं। इस मुद्दे को कम करने के लिए, नमूने चिपकने वाला स्लाइड पर एक हिस्टोलॉजिकल चिपकने वाला एजेंट के साथ पूरक एक पानी स्नान का उपयोग कर रखा जाना चाहिए, साथ ही उपयोग करने से पहले 65 डिग्री सेल्सियस के लिए सूखी स्लाइड पकाना. अंत में, माउस अंक अपेक्षाकृत छोटे हैं; इसलिए, सही रूप में आकृति विज्ञान कल्पना और हड्डी की मात्रा और लंबाई में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए, उचित स्कैनिंग मापदंडों पर कार्य करने के लिए पर्याप्त संकल्प का होना चाहिए।

इस विधि की एक सीमा यह है कि सभी प्राथमिक एंटीबॉडी ऊतक निर्धारण और पैराफिन प्रसंस्करण के साथ संगत नहीं हैं। इस घटना में, मानक जमे हुए ऊतक cryosectioning प्राथमिक एंटीबॉडी प्रतिजन11की अखंडता सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है। Cryosectioning भी decalcification कदम के लिए की जरूरत समाप्त, लेकिन हमने पाया है कि अंकों के cryosectioning तकनीकी रूप से पैराफिन अनुभागीकरण की तुलना में अधिक चुनौतीपूर्ण है.

पूरे blastema deconvolution माइक्रोस्कोपी द्वारा 10x आवर्धन पर कल्पना की जा सकती है, और, उचित छवि परिमाणीकरण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, इम्यूनोस्टेनिंग परिणाम आसानी से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. regenerating अंक के ऑस्टियोजेनिक मार्करों के लिए जांच फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अंतर्जातीय अस्थिकरण के माध्यम से ब्लास्टेमल भेदभाव का एक अनूठा दृश्य प्रदान करता है। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला से पता चलता है कि पी 3 हड्डी पुनर्जनन प्रतिक्रिया polarized है और संगठित समीपस्थ-से-डिसल हड्डी गठन में परिणाम (चित्र 2)। बाद में पुनर्जनन चरणों में, ब्लास्टेमा से व्युत्पन्न गैर-प्रजनन अस्थिकोरक ों को हड्डी स्टंप के निकट स्थानीयकृत किया जाता है और ऑस्टियोब्लास्ट्स को बढ़ाकर अलग-अलग रूप से घिरा होता है। इसके बदले में, ऑस्टियोब्लास्टों का प्रसार, असमान ब्लास्टेमल कोशिकाओं को उत्तेजित करने से अलग-अलग रूप से घिरा हुआ होता है। ब्लास्टेमा मार्कर CXCR4 के लिए जांच फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री घायल हड्डी की सतह के साथ जुड़े जल्दी ब्लास्टेमा कोशिकाओं की पहचान करता है जिसके बाद बाद में पुनर्जनन चरणों में बढ़ाया इम्यूनोस्टेनिंग होता है (चित्र2)। ब्लास्टेमा एक संवहनी13 और एंडोथेलियल सेल मार्कर vWF के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस है ब्लास्टेमा क्षेत्र के भीतर कुछ सकारात्मक कोशिकाओं की पहचान करता है (चित्र 2)।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम Muneoka लैब और जीनोमिक चिकित्सा के लिए टेक्सास संस्थान (TIGM) के सदस्यों को धन्यवाद. यह काम टेक्सास ए एंड एम विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein Block Serum Free DAKO X0909 Ready to use
Mouse anti-PCNA antibody Abcam ab29 1:2000 dilution
Rat anti-CXCR4 antibody R&D Systems MAB21651 1:500 dilution
Rabbit anti-human vWF XIII antibody DAKO A0082 1:800 dilution
Rabbit anti-osterix, SP7 antibody Abcam ab22552 1:400 dilution
Rabbit anti-Runx2 antibody Sigma-Aldrich Co. HPA022040 1:250 dilution
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A21235 1:500 dilution
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A11008 1:500 dilution
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Invitrogen A11077 1:500 dilution
Prolong Gold antifade reagent Invitrogen P36930 Ready to use
Surgipath Decalicifier 1 Leica Biosystems 3800400 Ready to use
Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative Anatech LTD 174 Ready to use
CD-1 Female Mouse Envigo ICR(CD-1) 8-12-weeks-old
vivaCT 40 SCANCO Medical

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 149 अंक विच्छेदन अधिरूपी पुनर्जनन अंतर्जातीय अस्थिकरण ऑस्टियोप्रोजेनेटर ब्लास्टेमा डेकल्सिफिकेशन फ्लोरोसेंस इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री माइक्रोकम्प्यूटेड टोमोग्राफी
वयस्क माउस अंक विच्छेदन और पुनर्जनन: एक सरल मॉडल मैमलियन Blastema गठन और Intramembranous Ossification की जांच करने के लिए
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Dawson, L. A., Brunauer, R., Zimmel, … More

Dawson, L. A., Brunauer, R., Zimmel, K. N., Qureshi, O., Falck, A. R., Kim, P., Dolan, C. P., Yu, L., Lin, Y. L., Daniel, B., Yan, M., Muneoka, K. Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification. J. Vis. Exp. (149), e59749, doi:10.3791/59749 (2019).

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