تصوير الميتوكوندريا والشبكية الإندوبلازمية بواسطة الضوء المترابطة والفحص المجهري للإلكترون الحجم
Summary
نقدم بروتوكول لدراسة توزيع الميتوكوندريا والشبكية endoplasmic في الخلايا الكاملة بعد التعديل الجيني باستخدام الضوء المترابطة وحجم المجهر الإلكتروني بما في ذلك أسكوربات بيروكسيداز 2 وتلطيخ البيروكسيداز الفجل، الاستئصال التسلسلي للخلايا مع وبدون الجين المستهدف في نفس القسم، والتصوير التسلسلي عن طريق المجهر الإلكتروني.
Abstract
إنشاء أعضاء خلوية، مثل الميتوكوندريا والشبكية الإندوبلازمية (ER)، شبكة لأداء مجموعة متنوعة من الوظائف. يتم طي هذه الهياكل المنحنية للغاية في أشكال مختلفة لتشكيل شبكة ديناميكية اعتمادا على الظروف الخلوية. وقد جرت محاولة تصور هذه الشبكة بين الميتوكوندريا وER باستخدام التصوير الفلوري فائق الاستبانة والفحص المجهري الخفيف؛ ومع ذلك، فإن القرار المحدود غير كاف لمراقبة الأغشية بين الميتوكوندريا وER بالتفصيل. يوفر الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال تباينًا جيدًا للغشاء واستبانة على نطاق النانومتر لمراقبة العضيات الخلوية؛ ومع ذلك، فإنه يستغرق وقتا ً طويلاً بشكل استثنائي عند تقييم بنية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) من العضيات المنحنية للغاية. لذلك، لاحظنا مورفولوجيا الميتوكوندريا وER عن طريق الفحص المجهري الإلكترون الخفيف النسبي (CLEM) وتقنيات الفحص المجهري للإلكترون الحجم باستخدام البيروكسيداز أسكوربات معززة 2 وتلطيخ البيروكسيداز الفجل. تم تطبيق طريقة تلطيخ الكتلة، والمقاطع التسلسلية رقيقة جدا (التصوير المقطعي للصفيف)، وحجم المجهر الإلكتروني لمراقبة بنية 3D. في هذا البروتوكول، نقترح مزيج من CLEM و3D المجهر الإلكتروني لإجراء دراسات هيكلية مفصلة من الميتوكوندريا وER.
Introduction
الميتوكوندريا والشبكية endoplasmic (ER) هي أعضاء خلوية مرتبطة بالغشاء. اتصالهم ضروري لوظيفتها، وقد وصفت البروتينات المتعلقة بشبكتهم1. وقد تم الإبلاغ عن المسافة بين الميتوكوندريا وER ما يقرب من 100 نانومتر باستخدام المجهرية الخفيفة2; ومع ذلك، كشفت الدراسات المجهرية فائقة الدقة3 والمجهرية الإلكترون (EM)4 أن تكون أصغر بكثير، في حوالي 10-25 نانومتر. الدقة التي تم تحقيقها في الفحص المجهري فائق الدقة أقل من EM، ووضع العلامات المحددة ضروري. EM هو تقنية مناسبة لتحقيق تباين عالية الدقة بما فيه الكفاية للدراسات الهيكلية للصلات بين الميتوكوندريا وER. ومع ذلك، العيب هو معلومات محور z محدودة لأن المقاطع رقيقة يجب أن يكون حوالي 60 نانومتر أو أرق لالإرسال التقليدي الإلكترون المجهري (TEM). للحصول على تصوير ثلاثي المحاور EM z-axis، يمكن استخدامالمجهر الإلكتروني ثلاثي الأبعاد (3DEM) 5. ومع ذلك، وهذا ينطوي على إعداد مئات من المقاطع التسلسلية رقيقة من الخلايا بأكملها، وهو عمل صعب جدا أن عدد قليل فقط من التقنيين المهرة يتقن. يتم جمع هذه المقاطع رقيقة على هشة formvar فيلم المغلفة شبكة TEM ثقب واحد. إذا كان الفيلم يكسر على حزام واحد، والتصوير التسلسلي وإعادة بناء حجم غير ممكن. الفحص المجهري الإلكتروني للمسح الضوئي التسلسلي للوجه (SBEM) هو تقنية شعبية لـ 3DEM يستخدم قسمالكتلة المدمرة داخل غرفة الفراغ بالمجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SEM) إما بسكين ألماس (Dik-SBEM) أو شعاع أيون مركز (FIB-SEM) 6.ومع ذلك، لأن هذه التقنيات غير متوفرة في جميع المرافق، نقترح التصوير المقطعي صفيف7 باستخدام التناقل التسلسلي وSEM. في التصوير المقطعي للصفيف، يتم نقل المقاطع التسلسلية المقطوعة باستخدام ميكروتومي فائق ة إلى غطاء زجاجي بدلاً من شبكة TEM وتصورها عبر الفحص المجهري الخفيف وSEM8. لتعزيز إشارة التصوير الإلكترون التشتت الخلفي (BSE)، استخدمنا بروتوكول تلطيخ EM كتلة استخدام تتكسيد أوزميوم (OsO4)-الخلايا الثابتة مع ثيوكاربوهيدرازيد osmiophilic (TCH)9،مما يتيح لنا الحصول على صور دون بعد تضمين تلطيخ مزدوج.
بالإضافة إلى ذلك, تم استخدام علامة الميتوكوندريا SCO1 (بروتين تجميع السيتوكروم ج أوكسيديز 1)– أسكوربات بيروكسيداز 2 (APEX2)10 العلامة الجزيئية لتصور الميتوكوندريا على مستوى EM. APEX2 هو ما يقرب من 28 كيلودا ومشتق من فول الصويا أسكوربات بيروكسيداز11. وقد تم تطويره لإظهار الموقع المفصل لبروتينات محددة على مستوى EM بنفس الطريقة التي يتم بها استخدام البروتين الأخضر الفلورسنت الموسومة في الفحص المجهري الخفيف. APEX2 يحول 3,3 ‘ -diaminobenzidine (DAB) إلى بوليمر osmiophilic غير قابل للذوبان في موقع العلامة في وجود بيروكسيد الهيدروجين العامل المساعد (H2O2). APEX2 يمكن استخدامها كبديل لوضع العلامات التقليدية للجسم المضاد في EM، مع توطين البروتين في جميع أنحاء عمق الخلية بأكملها. وبعبارة أخرى، يمكن تصور البروتين APEX2 الموسومة عن طريق التناضح محددة11 دون وضع العلامات المناعية ونفاذية بعد الترا cryoization. peroxidase الفجل (HRP) هو أيضا علامة حساسة أن يحفز H2O2تعتمد البلمرة من DAB في الرواسب المترجمة، وتوفير EM التباين بعد العلاج مع OsO4. تم تطبيق تسلسل الببتيد الهدف ER HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)12 لتصور ER داخل خلية كاملة. لتقييم بروتوكولنا لاستخدام العلامات الوراثية ووصمة عار الكتلة مع انخفاض osmium وTCH (طريقة rOTO)، وذلك باستخدام تأثير التناضح في نفس الوقت، قارنا تباين الغشاء مع وبدون استخدام كل علامة وراثية في rOTO en bloc تلطيخ. على الرغم من أن 3DEM مع التصوير المقطعي صفيف وDAB تلطيخ مع APEX وHRP قد استخدمت، على التوالي، لأغراض أخرى، بروتوكولنا فريد من نوعه لأننا قد الجمع بين التصوير المقطعي صفيف ل3DEM وDAB تلطيخ لالميتوكوندريا ووضع العلامات ER. على وجه التحديد، أظهرنا خمس خلايا مع وبدون الجينات ذات العلامات APEX في نفس القسم، مما ساعد في التحقيق في تأثير التعديل الوراثي على الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحديد التعريب الخلوي لبروتينات محددة بدقة نانومتر باستخدام EM أمر بالغ الأهمية لفهم الوظائف الخلوية للبروتينات. عموما، هناك نوعان من التقنيات لدراسة توطين البروتين المستهدف عن طريق EM. واحد هو تقنية مناعي، والتي تم استخدامها في EM منذ عام 1960، والآخر هو تقنية باستخدام العلامات المشفرة وراثي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا البحث من خلال برنامج البحوث الأساسية KBRI من خلال معهد كوريا لبحوث الدماغ بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (19-BR-01-08)، ومنحة مؤسسة البحوث الوطنية الكورية (NRF) التي تمولها حكومة كوريا (MSIT) (رقم. 2019R1A2C1010634) وتتكرم جامعة سيول الوطنية بتقديم البلازميدات من قبل شركة SCO1-APEX2 وHRP-KDEL. تم الحصول على بيانات TEM في المرافق الأساسية لأبحاث الدماغ في KBRI.
Materials
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | Use only in fume hood |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | Use only in fume hood |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 4 % aqueous solution | EMS | 16320 | Use only in fume hood |
| Epon 812 | EMS | 14120 | EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 – 0.8 ml |
| Ultra-microtome Leica ARTOS 3D | Leica | ARTOS 3D | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| 35mm Gridded coverslip dish | Mattek | P35G-1.5-14-CGRD | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| Formvar carbon coated Copper Grid | Ted Pella | 01805-F | |
| Hydrochloric acid | SIGMA | 258148 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Glycine | SIGMA | G8898 | |
| 3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) | SIGMA | D8001 | Hazardous chemical |
| 30% Hydrogen peroxide solution | Merck | 107210 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | SIGMA | P3289 | |
| 0.22 um syringe filter | Sartorius | 16534 | |
| Thiocarbonyldihydrazide | SIGMA | 223220 | Use only in fume hood |
| Potassium hydroxide | Fluka | 10193426 | |
| L-aspartic acid | SIGMA | A9256 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips | SPI | 06489-AB | fragil glass |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP2618-1 | |
| Diamond knife | Leica | AT-4 | |
| Inveted light microscopy | Nikon | ECLipse TS100 | |
| Scanning electron microscopy | Zeiss | Auriga |
References
- Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
- Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians. International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).
- Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).
- Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid–containing membranes and droplets in osmium tetroxide–fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
- Lee, S. Y., et al. APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest. Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons. Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Kijanka, M., et al. A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).
- Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX. Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).
- Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 7923 (2015).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein. PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).
- Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
