Summary
نقدم بروتوكول لدراسة توزيع الميتوكوندريا والشبكية endoplasmic في الخلايا الكاملة بعد التعديل الجيني باستخدام الضوء المترابطة وحجم المجهر الإلكتروني بما في ذلك أسكوربات بيروكسيداز 2 وتلطيخ البيروكسيداز الفجل، الاستئصال التسلسلي للخلايا مع وبدون الجين المستهدف في نفس القسم، والتصوير التسلسلي عن طريق المجهر الإلكتروني.
Abstract
إنشاء أعضاء خلوية، مثل الميتوكوندريا والشبكية الإندوبلازمية (ER)، شبكة لأداء مجموعة متنوعة من الوظائف. يتم طي هذه الهياكل المنحنية للغاية في أشكال مختلفة لتشكيل شبكة ديناميكية اعتمادا على الظروف الخلوية. وقد جرت محاولة تصور هذه الشبكة بين الميتوكوندريا وER باستخدام التصوير الفلوري فائق الاستبانة والفحص المجهري الخفيف؛ ومع ذلك، فإن القرار المحدود غير كاف لمراقبة الأغشية بين الميتوكوندريا وER بالتفصيل. يوفر الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال تباينًا جيدًا للغشاء واستبانة على نطاق النانومتر لمراقبة العضيات الخلوية؛ ومع ذلك، فإنه يستغرق وقتا ً طويلاً بشكل استثنائي عند تقييم بنية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) من العضيات المنحنية للغاية. لذلك، لاحظنا مورفولوجيا الميتوكوندريا وER عن طريق الفحص المجهري الإلكترون الخفيف النسبي (CLEM) وتقنيات الفحص المجهري للإلكترون الحجم باستخدام البيروكسيداز أسكوربات معززة 2 وتلطيخ البيروكسيداز الفجل. تم تطبيق طريقة تلطيخ الكتلة، والمقاطع التسلسلية رقيقة جدا (التصوير المقطعي للصفيف)، وحجم المجهر الإلكتروني لمراقبة بنية 3D. في هذا البروتوكول، نقترح مزيج من CLEM و3D المجهر الإلكتروني لإجراء دراسات هيكلية مفصلة من الميتوكوندريا وER.
Introduction
الميتوكوندريا والشبكية endoplasmic (ER) هي أعضاء خلوية مرتبطة بالغشاء. اتصالهم ضروري لوظيفتها، وقد وصفت البروتينات المتعلقة بشبكتهم1. وقد تم الإبلاغ عن المسافة بين الميتوكوندريا وER ما يقرب من 100 نانومتر باستخدام المجهرية الخفيفة2; ومع ذلك، كشفت الدراسات المجهرية فائقة الدقة3 والمجهرية الإلكترون (EM)4 أن تكون أصغر بكثير، في حوالي 10-25 نانومتر. الدقة التي تم تحقيقها في الفحص المجهري فائق الدقة أقل من EM، ووضع العلامات المحددة ضروري. EM هو تقنية مناسبة لتحقيق تباين عالية الدقة بما فيه الكفاية للدراسات الهيكلية للصلات بين الميتوكوندريا وER. ومع ذلك، العيب هو معلومات محور z محدودة لأن المقاطع رقيقة يجب أن يكون حوالي 60 نانومتر أو أرق لالإرسال التقليدي الإلكترون المجهري (TEM). للحصول على تصوير ثلاثي المحاور EM z-axis، يمكن استخدامالمجهر الإلكتروني ثلاثي الأبعاد (3DEM) 5. ومع ذلك، وهذا ينطوي على إعداد مئات من المقاطع التسلسلية رقيقة من الخلايا بأكملها، وهو عمل صعب جدا أن عدد قليل فقط من التقنيين المهرة يتقن. يتم جمع هذه المقاطع رقيقة على هشة formvar فيلم المغلفة شبكة TEM ثقب واحد. إذا كان الفيلم يكسر على حزام واحد، والتصوير التسلسلي وإعادة بناء حجم غير ممكن. الفحص المجهري الإلكتروني للمسح الضوئي التسلسلي للوجه (SBEM) هو تقنية شعبية لـ 3DEM يستخدم قسمالكتلة المدمرة داخل غرفة الفراغ بالمجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SEM) إما بسكين ألماس (Dik-SBEM) أو شعاع أيون مركز (FIB-SEM) 6.ومع ذلك، لأن هذه التقنيات غير متوفرة في جميع المرافق، نقترح التصوير المقطعي صفيف7 باستخدام التناقل التسلسلي وSEM. في التصوير المقطعي للصفيف، يتم نقل المقاطع التسلسلية المقطوعة باستخدام ميكروتومي فائق ة إلى غطاء زجاجي بدلاً من شبكة TEM وتصورها عبر الفحص المجهري الخفيف وSEM8. لتعزيز إشارة التصوير الإلكترون التشتت الخلفي (BSE)، استخدمنا بروتوكول تلطيخ EM كتلة استخدام تتكسيد أوزميوم (OsO4)-الخلايا الثابتة مع ثيوكاربوهيدرازيد osmiophilic (TCH)9،مما يتيح لنا الحصول على صور دون بعد تضمين تلطيخ مزدوج.
بالإضافة إلى ذلك, تم استخدام علامة الميتوكوندريا SCO1 (بروتين تجميع السيتوكروم ج أوكسيديز 1)– أسكوربات بيروكسيداز 2 (APEX2)10 العلامة الجزيئية لتصور الميتوكوندريا على مستوى EM. APEX2 هو ما يقرب من 28 كيلودا ومشتق من فول الصويا أسكوربات بيروكسيداز11. وقد تم تطويره لإظهار الموقع المفصل لبروتينات محددة على مستوى EM بنفس الطريقة التي يتم بها استخدام البروتين الأخضر الفلورسنت الموسومة في الفحص المجهري الخفيف. APEX2 يحول 3,3 ' -diaminobenzidine (DAB) إلى بوليمر osmiophilic غير قابل للذوبان في موقع العلامة في وجود بيروكسيد الهيدروجين العامل المساعد (H2O2). APEX2 يمكن استخدامها كبديل لوضع العلامات التقليدية للجسم المضاد في EM، مع توطين البروتين في جميع أنحاء عمق الخلية بأكملها. وبعبارة أخرى، يمكن تصور البروتين APEX2 الموسومة عن طريق التناضح محددة11 دون وضع العلامات المناعية ونفاذية بعد الترا cryoization. peroxidase الفجل (HRP) هو أيضا علامة حساسة أن يحفز H2O2تعتمد البلمرة من DAB في الرواسب المترجمة، وتوفير EM التباين بعد العلاج مع OsO4. تم تطبيق تسلسل الببتيد الهدف ER HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)12 لتصور ER داخل خلية كاملة. لتقييم بروتوكولنا لاستخدام العلامات الوراثية ووصمة عار الكتلة مع انخفاض osmium وTCH (طريقة rOTO)، وذلك باستخدام تأثير التناضح في نفس الوقت، قارنا تباين الغشاء مع وبدون استخدام كل علامة وراثية في rOTO en bloc تلطيخ. على الرغم من أن 3DEM مع التصوير المقطعي صفيف وDAB تلطيخ مع APEX وHRP قد استخدمت، على التوالي، لأغراض أخرى، بروتوكولنا فريد من نوعه لأننا قد الجمع بين التصوير المقطعي صفيف ل3DEM وDAB تلطيخ لالميتوكوندريا ووضع العلامات ER. على وجه التحديد، أظهرنا خمس خلايا مع وبدون الجينات ذات العلامات APEX في نفس القسم، مما ساعد في التحقيق في تأثير التعديل الوراثي على الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ثقافة الخلية مع نمط طبق ثقافة الشبكة وخلية transection مع SCO1-APEX2 وHRP-KDEL بلازميد ناقلات
- البذور 1 × 105 خلايا HEK293T عن طريق وضعها في 35 ملم الزجاج شبكة القاع أطباق الثقافة في جو رطب يحتوي على 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية في دولبكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني، 100 U / mL البنسلين، و100 U / مل العقديات.
- في اليوم التالي لبذر الخلايا، عندما نمت إلى 50٪ -60٪ من الملاءمة، وإدخال SCO1-APEX210 وHRP-KDEL12 بلازميد إلى الخلايا باستخدام كاشف الانف باستخدام كاشف الانقبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (SCO1-APEX2 cDNA 0.5 ميكروغرام + HRP-KDEL بلازميد الحمض النووي 0.5 ميكروغرام لكل 3 ميكرولتر كاشف).
2. مجهرية خفيفة من الخلايا التي تنمو على أطباق الثقافة منقوشة وتلطيخ DAB لAPEX2 وHRP
- في 16-24 ساعة بعد التغوط، وإزالة جميع وسائل الإعلام الثقافة وإضافة على الفور 250 درجةمئوية من الدافئة (30-37 درجة مئوية) حل التثبيت (الجدول 1) عن طريق الأنابيب لطيف. قم بإزالة حل التثبيت على الفور واستبداله بـ 1.5 مل من محلول التثبيت الطازج. حضانة على الجليد لمدة 60 دقيقة، ثم يغسل ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما في 1مل من الجليد البارد 0.1 M الصوديوم cacodylate العازلة (الجدول 1).
تحذير: أبخرة الألدهيد سامة للغاية. أداء جميع الأعمال تحت غطاء الدخان التهوية. - إضافة 1 مل من البرد (0-4 درجة مئوية) 20 مل محلول غليسين وحضانة لمدة 10 دقيقة على الجليد تليها ثلاث اذوش من 5 دقائق كل في 1 مل من الباردة 0.1 الصوديوم cacodylate العازلة.
- إعداد حل جديد 1X DAB (3.33 مل من 0.3 M حل cacodylate + 10 ميكرولتر من 30٪ H2O2 + 5.67 مل من الماء البارد + 1 مل 10X حل DAB).
- إضافة 500 درجة مئوية من الحل 1X DAB المعدة حديثا (الخطوة 2.3) وحضانة على الجليد لمدة 5-45 دقيقة تقريبا حتى وصمة عار البني الفاتح مرئية تحت المجهر الضوئي المقلوب (الشكل1A).
- قم بإزالة محلول DAB بلطف واشطفه ثلاث مرات بسعة 1 مل من المخزن الاحتياطي البارد بـ 0.1 متر من الصوديوم لمدة 10 دقائق لكل منهما.
- استخدم مجهرم مقلوب على النقيض من المرحلة (أو مجهر ضوء مشرق) لتصور تلطيخ DAB عند تكبير 100 x أو أعلى. استخدم قلم علامة لوضع علامة على الجزء السفلي من الزجاج حيث تقع منطقة الاهتمام (ROI) (الشكل1B,C).
3. إعداد عينة لكتلة EM
- تنفيذ ثقافة الخلية وتلطيخ DAB كما هو موضح في الخطوات 2.1-2.6.
- بعد إصلاح العينات مع 1 مل من 2٪ خفضت OsO4 لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية.
تحذير: أبخرة OsO4 شديدة السمية. أداء جميع الأعمال تحت غطاء الدخان التهوية. - إعداد حل TCHجديد (الجدول 1) أثناء الخطوة 3.2 وتمرير من خلال عامل تصفية 0.22-m.
تحذير: أبخرة TCH شديدة السمية. أداء جميع الأعمال تحت غطاء الدخان التهوية. - إزالة المثبت وشطف ثلاث مرات مع 1 مل من الماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل منهما في درجة حرارة الغرفة (RT).
- ضع الخلايا في 1 مل من محلول TCH الذي تم إعداده وتصفيته مسبقًا لمدة 20 دقيقة في RT.
- شطف الخلايا ثلاث مرات مع 1 مل من الماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل منهما في RT.
- كشف الخلايا مرة ثانية إلى 1 مل من 2٪ أوستروكسيد أوزميوم في الماء المقطر لمدة 30 دقيقة في RT.
- إزالة المثبت وشطف ثلاث مرات مع 1 مل من الماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل في RT. إضافة 1 مل من 1٪ خلات أورانيل (مائي)، وترك بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في الظلام.
- غسل الخلايا ثلاث مرات في 1 مل من الماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل منهما في RT.
- قبل الدافئة والتون الرصاص حل أسبارتات (الجدول 1) في فرن في 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- وصمة عار الخلايا مع حل الأسبارتات الرصاص والتون عن طريق إضافة 1 مل من محلول الأسبارتات الرصاص قبل تسخينها، ثم وضعها في فرن لمدة 30 دقيقة في 60 درجة مئوية.
- شطف الخلايا ثلاث مرات مع 1 مل من الماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل منهما في RT.
- حضانة في سلسلة متدرجة من 2-مل الإيثانول aliquots (50٪، 60٪، 70٪، 80٪، 90٪، 95٪، 100٪، 100٪) لمدة 20 دقيقة لكل منهما في RT.
- Decant الإيثانول والحضانة لمدة 30 دقيقة في 1 مل من 3:1 الإيثانول: منخفضة اللزوجة تضمين خليط المتوسطة في RT.
- إزالة المتوسطة وإضافة 1 مل من 1:1 الإيثانول: منخفضة اللزوجة تضمين خليط المتوسطة. حضانة لمدة 30 دقيقة في RT.
- إزالة المتوسطة وإضافة 1 مل من 1:3 الإيثانول: منخفضة اللزوجة تضمين خليط المتوسطة. حضانة لمدة 30 دقيقة في RT.
- إزالة المتوسطة وإضافة 1 مل من 100٪ منخفضة اللزوجة تضمين المتوسطة وحضانة بين عشية وضحاها.
- قم بتضمين العينة في خليط تضمين اللزوجة المنخفضة 100% وحضانة لمدة 24 ساعة عند 60 درجة مئوية.
- إعداد 90 نانومتر أقسام سميكة باستخدام ultramicrotome.
- مراقبة الشبكة تحت TEM في 200 كيلوفولت.
4. المقاطع التسلسلية وتصاعد على الأغطية المغلفة الإنديوم والقصدير أكسيد لتصوير SEM
-
إعداد الركيزة
- غطاء زجاجي مغطى بالإنديوم والقصدير (ITO) (22 مم × 22 مم) بواسطة الهياج اللطيف في إيزوبروبانول لمدة 30-60 ثوان.
- إزالة الأغطية، واستنزاف قبالة isopropanol الزائدة، وترك في بيئة خالية من الغبار حتى تجف.
- علاج الأغطية الزجاجية المغلفة بـ ITO بواسطة التفريغ المتوهج باستخدام معطف البلازما لمدة دقيقة واحدة.
ملاحظة: تنشيط البلازما يمنح خاصية مائية على سطح الركيزة. فإنه يخلق فيلم رقيقة جدا من الماء على الركيزة لمنع تشكيل التجاعيد في الأقسام عندما يتم إرفاق القسم إلى الركيزة. - أدخل الأغطية الزجاجية المغلفة بـ ITO في حامل الركيزة، ووضعها في قارب السكين.
-
تقليم كتلة عينة والمقاطع التسلسلية
- إدراج كتلة عينة في حامل عينة من ultramicrotome وتعيين في كتلة التشذيب.
- استخدام شفرة الحلاقة لتقليم بعيدا كل الراتنج الزائد حول الموقف المستهدف (المحددة في الخطوة 2.6، الشكل 1D-G). يجب أن يكون شكل وجه كتلة شبه منحرف أو مستطيلة. يجب أن تكون الحافة الرائدة والحافة الزائدة موازية تماما (الشكل1H،I).
- إدراج حامل العينة على ذراع ultramicrotome ووضع سكين الماس في حامل السكين. إدراج الأغطية الزجاجية ITO في الناقل الشريط والمشبك الناقل مع مقبض (الشكل1J). تعيين الناقل الشريط في قارب سكين وملء القارب سكين مع الماء المقطر المصفاة (الشكل1K).
- ضبط موقف الناقل مع الشريحة من السكين عن طريق دفع بعناية مقبض حامل لتعيين حافة الزجاج ITO على مقربة من السكين (الشكل1L).
- بعد قطع القسم، ووقف عملية القسم، وفتح ببطء المسمار لقط من أنبوب واستنزاف القارب المائي (معدل تدفق قطرة واحدة من الماء في الثانية الواحدة).
- بعد الانتهاء من عملية جمع الشريط، وإزالة الركيزة مع مقبض الجهاز لقط وتجفيف الشريط (الشكل1M).
5. التصوير في SEM ومحاذاة مكدس الصور SEM
- قم بتركيب غطاء الغطاء المطلي بـ ITO على كعب الألومنيوم مع شريط الكربون اللزج. ختم سطح الزجاج والسطح في كعب مع شريط الكربون لزجة، ومن ثم معطف مع طبقة الكربون سميكة 10 نانومتر (الشكل1N).
- مراقبة غطاء المغلفة ITO في حقل الانبعاثات SEM في الجهد تسارع منخفض من 5 كيلوفولت ومسافة عمل مناسبة لجمع كفاءة من BSEs.
- استيراد الصور التسلسلية إلى برنامج صورة J (فيجي)13 باستخدام الخيار مكدس الظاهري. فتح TrakEM14جديدة ، واستيراد كومة الصور في TrakEM. انقر فوق زر الماوس الأيمن واختر قائمة المحاذاة.
- ثم حدد نطاق الصورة (من الصورة الأولى إلى الصورة الأخيرة). قم بإنهاء المحاذاة التلقائية، واحفظ مجموعة البيانات المحاذية، واختر التصدير لتجميع صورة مسطحة من نطاق الصورة المحدد (من الصورة الأولى إلى الصورة الأخيرة). وأخيراً، حفظ بيانات الصورة المسطحة بتنسيق AVI في القائمة الرئيسية صورة J.
ملاحظة: الفيلم التكميلي 1 والفيلم التكميلي 2 إظهار مكدس الصور SEM ومكدس الصور اقتصاص، على التوالي.
6- تجزئة الميتوكوندريا وER من الصور المسلسلة
- بدء تشغيل 3dmod في برنامج IMOD15 وفتح ملفات الصور.
- في إطار ZaP، ارسم محيط الميتوكوندريا وER باستخدام زر الماوس الأوسط.
- لتصور وحدة التخزين المجزأة، افتح نافذة عرض الطراز (فيلمتكميلي3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف الشكل 1 الجدول الزمني وسير العمل لهذا البروتوكول. يتطلب البروتوكول 7 أيام؛ ومع ذلك، اعتماداً على الوقت المستغرق في التصوير SEM، قد يزيد هذا. لتبديل الخلايا، ينبغي التحكم في تزامن الخلايا حتى لا تغطي الجزء السفلي من لوحة الشبكة بأكملها (الشكل1A). يمكن أن تمنع كثافة الخلايا العالية تحديد الخلية ذات الأهمية أثناء المجهر الضوئي ومراقبة EM. استخدمنا بلازميدات ذات علامات وراثية تعبر عن APEX2 وHRP لاختيار الخلايا المنقولة بكفاءة بين الخلايا المستزرعة العديدة في طبق الثقافة. نحن زراعة خلايا HEK293T وأكد التعبير عن قمة 2 المرتبطة بـ SCO1 (الفضاء بين الأغشية الميتوكوندريا [IMS]) وKDEL المترافقة HRP (ER) في الخلايا المشتركة. تحت الفحص المجهري الخفيف، كانت الخلايا المنكرة APEX2 ملطخة بلون بني، في حين ظلت الخلايا دون التغوط غير ملطخة (الشكل1A والشكل 2). وسمح ذلك بتحديد الخلايا المستهدفة المنقولة، التي استخدمت بعد ذلك في الفحص المجهري للإلكترون الخفيف المترابطة (CLEM)، باستخدام تلطيخ الداب في مجموعة الخلايا المستزرعة (الشكل3D-F والشكل 4B). كان من المفيد وضع علامة على أسفل الزجاج (الشكل1B،C) لجعل من السهل تحديد موقع الخلية المستهدفة خلال خطوة التضمين المسطحة (الشكل1E،F). عندما تم التعامل مع الخلايا HEK293T مع تعزيز "التناضح المزدوج" بروتوكول تلطيخ (rOTO)، كانت ملطخة الخلايا كلها لون داكن (الشكل1D). بعد إزالة غطاء الشبكة من طبق الثقافة، حددنا الموقع المستهدف على سطح كتلة تحت المجهر ستيريو (الشكل1G). قمنا بتقليص الخلايا في عائد الاستثمار في شكل شبه منحرف، وجعلت حواف الرائدة وزائدة موازية (الشكل1H، I). لتنفيذ الميتوكوندريا وإعادة بناء شبكة ER، استخدمنا سكين الماس كبيرة مع قارب مائي كبير للقسم تسلسلي SCO1-APEX2 وHRP-KDEL-التعبير عن خلايا HEK293T (الشكل1J-L). تم إرفاق المقاطع الشريط ية سميكة 90 نانومتر بنجاح إلى غطاء الزجاج المغلفة ITO (الشكل1M)،وكان المغلفة السطح مع الكربون السميك 10 نانومتر للمراقبة عن طريق SEM (الشكل1N).
البروتينات SCO1-APEX2 وHRP-KDEL تولد إشارات إلكترونية كثيفة للغاية مشتقة من تحويل DAB التي يمكن الكشف عنها في TEM (الشكل 3) وSEM (الشكل4). وقد لوحظ تصبغالظلام التي ولدتها SCO1-APEX2 حصرا في IMS وليس في الفضاء مصفوفة الميتوكوندريا (الشكل3D). وأعرب كل من الخلايا المنكرة (الخلية اليسرى في الشكل 3D،E)مع كل من SCO1-APEX2 وHRP-KDEL بلازميدات إشارة إلكترون كثيفة للغاية في IMS الميتوكوندريا وER؛ ومع ذلك، لاحظنا أي تلطيخ ER في الخلايا التي تم نقلها فقط مع SCO1-APEX2 (الخلية اليمنى في الشكل 3D، F). للصور التسلسلية باستخدام SEM، أولا، أنشأنا نظرة عامة على صورة مجموعة كاملة باستخدام كاشف BSE على مساحة كبيرة (الشكل4A). ثانياً، تم وضع عائد الاستثمار في القسم الأول ونشره على جميع الأقسام الأخرى (الشكل4B). وأخيرا، تصورنا عائد الاستثمار الذي يحتوي على خمس خلايا مستهدفة مع بكسل صورة 5 نانومتر (الشكل4C). كشفت الصور التي تم تكبيرها عن هياكل دون خلوية مفصلة (الشكل4D)مثل جهاز غولجي، الميتوكوندريا، النوى، وER. وأظهرت الصور التسلسلية بوضوح أن الاتصالات ER-الميتوكوندريا كانت تحدث على طائرات Z مختلفة (الفيلمالتكميلي 2 والفيلم التكميلي 3).
الشكل 1 S: سير عمل إعداد وافرة لSEM وTEM. (أ) طبق ثقافة يحتوي على الأغطية المشبكة بذر مع الخلايا وملطخة DAB. (باء،جيم) بعد تلطيخ DAB، تم استخدام قلم علامة لوضع علامة على الجزء السفلي من الزجاج حيث تم تحديد موقع الخلايا المستهدفة. (D) بعد OقO4 تلطيخ، والخلايا تصبح لون داكن. (E,F) تم استخدام أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) (أو أي نوع من كبسولات التضمين) لجعل كتلة EM التي تحتوي على المواضع المميزة بسهولة. (E) أعلى عرض. (F) عرض أسفل. (G) صورة مجهرية ستيريو منخفضة التكبير من سطح كتلة EM. (H) عائد الاستثمار هو في منتصف السطح المسطح. (I) صورة مجهرية ستيريو أعلى التكبير من عائد الاستثمار مستطيلة. (J) يتم إدراج الأغطية الزجاجية المغلفة بـ ITO (العلامة النجمية البيضاء) في حامل الشريط (السهم الأزرق)، ويتم تثبيت الحامل عن طريق تحويل المقبض في اتجاه عقارب الساعة. (K,L) يتم دفع مقبض حامل بعناية، ويتم تعديل الناقل لوضع حافة غطاء الزجاج المغلفة ITO على مقربة من السكين عن طريق الانزلاق. (M) يتم إرفاق شرائط إلى الأغطية الزجاجية المغلفة ITO. (N) يتم إرفاق الأغطية الزجاجية المغلفة بـ ITO بكعب SEM، ويتم إغلاق الزجاج المتبقي بشريط كربون لزج ومطلي بطبقة خيط كربونية تبلغ 10 نانومتر. تشير العلامات النجمية البيضاء إلى غطاء الزجاج المطلي بـ ITO، وتشير العلامات النجمية السوداء إلى شريط الكربون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صورة مجهرية مقلوبة على النقيض من المرحلة لخلايا HEK293T المستزرعة الملطخة بـ DAB. (أ) تلطيخ الخلايا مع DAB فقط (بدون OsO4 تلطيخ). تشير الأسهم البيضاء إلى الخلايا غير الملطخة، وتشير الأسهم السوداء إلى الخلايا الملطخة بـ DAB. (ب) صورة أعلى تكبير لعائد الاستثمار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 تصوير TEM لخلايا HEK293T التي تعرض IMS الميتوكوندريا المستهدفة (SCO1-APEX2) وER (HRP-KDEL). (ألف-جيم) خلايا HEK293T غير المنقولة التي تظهر الغشاء المزدوج من الميتوكوندريا (M) والشبكية الإندوبلازمية (ER). (د-واو) APEX2 وHRP حفز البلمرة من DAB في الترسيب المحلي، والتي هي في وقت لاحق ملطخة مع الإلكترون كثيفة OsO4. تباين مظلمة واضحة في ال [إيندملتل] [إيمس] (رأس سهم سوداء) و [إر] (سهم سوداء); ومع ذلك، تظهر الخلايا التي لم يتم نقلها مع HRP-KDEL ER غير ملطخة (السهم الأبيض). قضبان المقياس: 1 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التصوير المتسلسل لخلايا HEK293T التي تعرض نظام الرصد الدولي الميتوكوندريا المستهدف (SCO1-APEX2) وER (HRP-KDEL). (أ) نظرة عامة على شرائط المقطع التسلسلي التي لوحظت باستخدام كاشف BSE. (B) ارتباط صورة التكبير المنخفض (inset) مع صورة BSE عالية التكبير (مربع خط منقط أبيض يشير إلى عائد الاستثمار من الخلايا الملطخة DAB). (C) تكبير عالية من الخلايا المستهدفة عائد الاستثمار مع بكسل صورة 5 نانومتر. (D,E) وهناك تناقض مظلم واضح في IMS الميتوكوندريا وER ولكن ليس جهاز غولجي. (واو-أولا) تحدث جهات الاتصال ER-الميتوكوندريا (السهم الأبيض) على طائرات Z مختلفة. N، نواة؛ M, الميتوكوندريا; ER، الشبكية الإندبلازمية. G، جهاز غولجي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: وصفات الحل.
تكميلية الفيلم 1: SEM صورة المكدس. فيجي13 مع TrakEM14 تم استخدام البرمجيات لمحاذاة 91 صورة. مجموعة البيانات المحاذية الأصلية هي 11 غيغابايت. لتقليص حجم المكدس، تم استخدام مجموعة الصور التي تم تغيير حجمها واقتصاصها. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
الفيلم التكميلي 2: مكدس الصور اقتصاص. لتصور الميتوكوندريا، ER، ومواقع الاتصال الخاصة بهم بالتفصيل، تم اقتصاص الصور من مجموعة البيانات الأصلية (5 نانومتر / بكسل). قضبان المقياس: 1 μm. الرجاء النقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
الفيلم التكميلي 3: إعادة بناء 3D من الميتوكوندريا وER. بالنسبة للتصور ثلاثي الأبعاد، تم تقسيم محيط الميتوكوندريا وER وتصورها باستخدام برنامج IMOD15. تم تصور الميتوكوندريا كما الهياكل الأنبوبية طويلة (الأحمر)، وشبكات ER (الأخضر) أظهرت مورفولوجيا معقدة. الأصفر يمثل مساحة كبيرة من موقع الاتصال بين الميتوكوندريا وER في طائرات Z مختلفة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحديد التعريب الخلوي لبروتينات محددة بدقة نانومتر باستخدام EM أمر بالغ الأهمية لفهم الوظائف الخلوية للبروتينات. عموما، هناك نوعان من التقنيات لدراسة توطين البروتين المستهدف عن طريق EM. واحد هو تقنية مناعي، والتي تم استخدامها في EM منذ عام 1960، والآخر هو تقنية باستخدام العلامات المشفرة وراثيا وضعت مؤخرا16. وقد استخدمت تقنيات الذهب المناعي التقليدية جزيئات الذهب المترافقة بالأجسام المضادة أو نقاط الكم لإظهار موقع البروتين المسمى. ومع ذلك، نظرا لمتطلبات الأجسام المضادة عالية الجودة وكفاءة اختراق الأجسام المضادة المتضررة من الراتنج والمثبت، وهذه التقنية محدودة إلى حد كبير17. على وجه التحديد، لأن وضع العلامات المناعية يقتصر في الغالب على سطح قسم رقيقة جدا دون تلطيخ المعادن في كتلة وتثبيت أوزميوم قوي، وهذه التقنية لا تنطبق مباشرة على الحديثة 3DEM18. لاستخدام الأساليب 3DEM الأخيرة، بما في ذلك SBEM والتصوير المقطعي صفيف، مع وضع العلامات البروتين، استخدمنا علامات EM المشفرة وراثيا في هذا البروتوكول. لا تتطلب العلامات المشفرة وراثياً نفاذية، وتتطلب تقنياً تشريحاً فائقالبرود، وتلطيخ اشعاعات أقسام فردية لأنها تُترجم إلى موقع الاهتمام قبل التثبيت.
وتشمل إجراءات إعداد العينة في 3DEM عموما مزيج من التثبيت الكيميائي المشترك وطرق تلطيخ المعادن الثقيلة لأن الخلايا تتكون أساسا من C، H، O، و N، مما يتطلب تلطيخ مع المعادن الثقيلة للحصول على التباين تحت EM9 . لذلك، وظفنا انخفاض تثبيت osmium وتلطيخ المعادن لتعزيز التباين والموصلية للتصوير التسلسلي. وقد تم الإبلاغ عن إجراء لوصمة عار العينات قبل تقسيم، والمعروفة باسم تلطيخ كتلة، كخطوة أساسية لأساليب 3DEM مثل SBEM وFIB-SEM19. وأكدنا أن الخلايا الملطخة بالكتلة في بروتوكولنا أظهرت واضحة SCO1-APEX2 وHRP-KDEL EM التباين حصرا في IMS الميتوكوندريا وER، على التوالي، في TEM (الشكل3). وعلاوة على ذلك، كشفت الصور SEM من المقاطع التسلسلية90 نانومتر تباين واضح في كل من العضيات (الشكل 4). وتجدر الإشارة إلى أن التباين المعزز من خلال تلطيخ الكتلة كان متميزاً بشكل واضح عن إشارة DAB،وأدى التباين والموصلية إلى صور تسلسلية جيدة الجودة (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك، يساعد هذا التباين العالي على تسهيل المهام اللاحقة مثل المحاذاة والتجزئة مع برنامج الصور ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد).
في السنوات الأخيرة، وقد أجاب حجم تقنيات الفحص المجهري الإلكترون (ديك-SBEM، FIB-SEM، والتصوير المقطعي صفيف) الأسئلة البيولوجية التي تتطلب مراقبة مجال رؤية كبير وعرض 3D. لا تنطوي Dik-SBEM وFIB-SEM على المعالجة المادية للأقسام، لذلك يمكن تقليل الوقت الذي يستغرق لمحاذاة الصور. ومع ذلك، يجب تدمير العينة للحصول على الصور التسلسلية، ومجال العرض أصغر من مجال التصوير المقطعي للصفيف. يتم استخدام التصوير التسلسلي SEM باستخدام التصوير المقطعي صفيف على نحو متزايد كبديل للقسم التسلسلي TEM، والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي طريقتها غير المدمرة ومجال الرؤية الكبير. خلافا لتقنيات 3DEM الأخرى مثل ديك-SBEM وFIB-SEM، يمكن تخزين أقسام على غطاء، غطاء المغلفة ITO، رقاقة السيليكون، أو شريط ويمكن تصويرها مرارا وتكرارا7.
APEX2 سهلة الاستخدام ويمكن أن تعطي مجموعة واسعة من الكثافات تلطيخ دون معدات خاصة، على عكس مصغرة مولد الأكسجين singlet20 أو البروتين الفلورسنت21 تقنيات، وتوليد الأمطار DAB عن طريق الأكسدة الضوئية. وقد تم اختبار تطبيقه المتغير في العديد من العضيات الخلوية بما في ذلك النواة، غشاء البلازما، مصفوفة الميتوكوندريا، كريستا الميتوكوندريا، ER، توبولين، والأكتين في COS 7 وHEK293T الخلية22. ومع ذلك، هناك بعض القيود والعديد من نقاط التفتيش لاستخدام العلامات المشفرة وراثيا في الميكروغرافيا الإلكترونية. يجب التحكم في مستويات التعبير من الجينات الخارجية لتحقيق تلطيخ معقول على مستوى EM لأنه إذا كان التعبير عن العلامة الوراثية عالية جدا، فإنه قد يؤدي إلى إشارات إيجابية كاذبة واضطراب البنية الفوقية للخلايا عن طريق تمزق الغشاء وتراكم الأعضاء تحت الخلوية23. وهناك مشكلة أخرى محتملة هي الإفراط في تلطيخ DAB، والتي تم الإبلاغ عنأنها تسبب الضبابية وتدمير الغشاء22. لضمان التعبير المناسب للجينات، تمت مقارنة الخلايا الملطخة بـ DAB بالخلايا غير الملطخة باستخدام كل من الفحص المجهري الخفيف وEM (الشكل2 والشكل 3). بالإضافة إلى ذلك، ينبغي تنظيم مستوى التثبيت بشكل جيد لضمان أن المؤكسدات الذاتية غير نشطة تماما. لمنع أي قطع أثرية من المؤكسدات الذاتية أثناء المعالجة، قمنا بإصلاح طبقة أحادية من الخلايا بدلا من استخدام خلايا منفصلة وبيليه24. وساعد ذلك أيضا على تحديد الخلايا ذات الأهمية عندما فحصنا إشارة DAB تحت الفحص المجهري الخفيف. وهكذا، تشير نتائجنا إلى أن تلطيخ وتثبيت الطبقات الأحادية الخليةمفيدة لCLEM باستخدام تلطيخ DAB (الشكل 2). كشفت الصور التسلسلية مع التصوير المقطعي صفيف ونموذج 3D أن مواقع الاتصال ER-الميتوكوندريا تحدث على طائرات Z مختلفة (الفيلمالتكميلي 2 والفيلم التكميلي 3). الصورة تنتج تصور 3D كاملة من الميتوكوندريا وشبكات ER في خلايا كاملة (فيلمتكميلي 1). وهو يشير إلى أن تحليل حجم 3D ضروري للمقارنة الكمية للاتصالات ER-الميتوكوندريا. عند دراسة الشبكات المعقدة من العضيات داخل الخلايا، وهذا هو تقنية مفيدة بشكل استثنائي.
وفي الختام، كان هذا البروتوكول مزيجاً فعالاً من تقنيات CLEM و3DEM التي سمحت بإجراء تحقيق في الخلايا بأكملها على مستوى EM. وتجدر الإشارة إلى أن علامتين مختلفتين في نفس الوقت وإشارات DAB في عضوين مختلفين كانتا مرئيتين في خلية كاملة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن مقارنة الخلايا المسماة والخلايا غير المسماة في نفس المقطع، بسبب EM على نطاق واسع. في هذا البروتوكول، كانت إشارات تلطيخ الكتلة وDAB من العلامات المشفرة وراثيا مفيدة للتحقيق في التفاعل بين العضيات السامة في خلايا كاملة. هذا يمكن أن يكون تطبيق مناسب لEM واسعة النطاق للتحقيق في التفاعلات الخلوية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا البحث من خلال برنامج البحوث الأساسية KBRI من خلال معهد كوريا لبحوث الدماغ بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (19-BR-01-08)، ومنحة مؤسسة البحوث الوطنية الكورية (NRF) التي تمولها حكومة كوريا (MSIT) (رقم. 2019R1A2C1010634) وتتكرم جامعة سيول الوطنية بتقديم البلازميدات من قبل شركة SCO1-APEX2 وHRP-KDEL. تم الحصول على بيانات TEM في المرافق الأساسية لأبحاث الدماغ في KBRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | Use only in fume hood |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | Use only in fume hood |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 4 % aqueous solution | EMS | 16320 | Use only in fume hood |
| Epon 812 | EMS | 14120 | EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml |
| Ultra-microtome Leica ARTOS 3D | Leica | ARTOS 3D | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| 35mm Gridded coverslip dish | Mattek | P35G-1.5-14-CGRD | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| Formvar carbon coated Copper Grid | Ted Pella | 01805-F | |
| Hydrochloric acid | SIGMA | 258148 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Glycine | SIGMA | G8898 | |
| 3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) | SIGMA | D8001 | Hazardous chemical |
| 30% Hydrogen peroxide solution | Merck | 107210 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | SIGMA | P3289 | |
| 0.22 um syringe filter | Sartorius | 16534 | |
| Thiocarbonyldihydrazide | SIGMA | 223220 | Use only in fume hood |
| Potassium hydroxide | Fluka | 10193426 | |
| L-aspartic acid | SIGMA | A9256 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips | SPI | 06489-AB | fragil glass |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP2618-1 | |
| Diamond knife | Leica | AT-4 | |
| Inveted light microscopy | Nikon | ECLipse TS100 | |
| Scanning electron microscopy | Zeiss | Auriga |
References
- Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
- Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians. International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).
- Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).
- Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
- Lee, S. Y., et al. APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest. Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons. Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Kijanka, M., et al. A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).
- Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX. Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).
- Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 7923 (2015).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein. PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).
- Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
