Summary
Presentiamo un protocollo per studiare la distribuzione di mitocondri e reticolo endoplasmico in intere cellule dopo la modificazione genetica utilizzando la microscopia elettronica di luce e volume correlata, tra cui l'ascorbate perossidasi 2 e la colorazione della perossidia di rafano, sezionamento seriale di cellule con e senza il gene bersaglio nella stessa sezione e imaging seriale tramite microscopia elettronica.
Abstract
Gli organelli cellulari, come i mitocondri e il reticolo endolasmico (ER), creano una rete per svolgere una varietà di funzioni. Queste strutture altamente curve sono piegate in varie forme per formare una rete dinamica a seconda delle condizioni cellulari. La visualizzazione di questa rete tra mitocondri ed ER è stata tentata utilizzando l'imaging a fluorescenza a super-risoluzione e la microscopia leggera; tuttavia, la risoluzione limitata non è sufficiente per osservare in dettaglio le membrane tra i mitocondri e il ER. La microscopia elettronica a trasmissione fornisce un buon contrasto della membrana e una risoluzione su scala nanometrica per l'osservazione degli organelli cellulari; tuttavia, è eccezionalmente dispendioso in termini di tempo quando si valuta la struttura tridimensionale (3D) di organelli altamente curvi. Pertanto, abbiamo osservato la morfologia dei mitocondri e del ER attraverso la microscopia correlativa degli elettroni di luce (CLEM) e le tecniche di microscopia elettronica del volume utilizzando una maggiore perossia ascorbate 2 e la colorazione della perossia di rafano. Un metodo di colorazione en bloc, la sezionamento seriale ultrasottile (tomografia a matrice) e la microscopia elettronica del volume sono stati applicati per osservare la struttura 3D. In questo protocollo, suggeriamo una combinazione di microscopia elettronica CLEM e 3D per eseguire studi strutturali dettagliati di mitocondri ed ER.
Introduction
I mitocondri e i reticoli endolasmici (ER) sono organelli cellulari legati alla membrana. La loro connessione è necessaria per la loro funzione, e le proteine legate alla loro rete sono state descritte1. La distanza tra i mitocondri e il ER è stata riportata come circa 100 nm utilizzando la microscopia luminosa2; tuttavia, recenti studi di microscopia a super-risoluzione3 ed elettroscopia (EM)4 hanno rivelato che è notevolmente più piccolo, a circa 10-25 nm. La risoluzione raggiunta nella microscopia a super-risoluzione è inferiore a EM ed è necessaria un'etichettatura specifica. EM è una tecnica adatta per ottenere un contrasto sufficientemente ad alta risoluzione per gli studi strutturali delle connessioni tra mitocondri e ER. Tuttavia, uno svantaggio è rappresentato dalle informazioni limitate sull'asse z, in quanto le sezioni sottili devono essere di circa 60 nm o più sottili per la microscopia elettronica a trasmissione convenzionale (TEM). Per una sufficiente imaging dell'asse z EM, è possibile utilizzare la microscopia elettronica tridimensionale (3DEM)5. Tuttavia, questo comporta la preparazione di centinaia di sottili sezioni seriali di intere cellule, che è un lavoro molto difficile che solo pochi tecnologi qualificati hanno imparato. Queste sezioni sottili vengono raccolte su griglie TEM a foro rivestite con pellicola di forma fragile. Se il film si rompe su una cintura, l'imaging seriale e la ricostruzione del volume non sono possibili. La microscopia elettronica a scansione seriale a blocchi (SBEM) è una tecnica popolare per 3DEM che utilizza la sezionamento distruttivo del blocco all'interno della camera a vuoto del microscopio elettronico a scansione (SEM) con un coltello a diamante (Dik-SBEM) o un fascio ionico focalizzato (FIB-SEM) 6. Tuttavia, poiché tali tecniche non sono disponibili in tutte le strutture, suggeriamo la tomografia array7 utilizzando il sezionamento seriale e SEM. Nella tomografia a matrice, le sezioni seriali tagliate con un ultramicrotoma vengono trasferite su una vetrina di vetro invece di una griglia TEM e visualizzate tramite microscopia leggera e SEM8. Per migliorare il segnale per l'imaging di elettroni backscatter (BSE), abbiamo utilizzato un protocollo di colorazioneen bloc EM che impiega cellule fisse osmioum tetrossido (OsO 4) con thiocarbohydrazide (TCH)9osmiofilia doppia colorazione post-incorporamento.
Inoltre, il marcatore mitocondriale SCO1 (proteina di assemblaggio citocromatico c ossidasi 1)– ascorbate peroxidase 2 (APEX2)10 tag molecolare è stato utilizzato per visualizzare i mitocondri a livello di EM. APEX2 è di circa 28 kDa ed è derivato da soia ascorbate perossidasi11. È stato sviluppato per mostrare la posizione dettagliata di proteine specifiche a livello EM nello stesso modo in cui la proteina con etichettatura proteica fluorescente verde viene utilizzata nella microscopia leggera. APEX2 converte 3,3' -diaminobenzidina (DAB) in un polimero osmiofilo insolubile nel sito del tag in presenza del cofattore di perossido di idrogeno (H2O2). APEX2 può essere utilizzato come alternativa all'etichettatura tradizionale degli anticorpi in EM, con una localizzazione delle proteine per tutta la profondità dell'intera cellula. In altre parole, la proteina con etichetta APEX2 può essere visualizzata mediante osmicazione specifica11 senza etichettatura immunogold e permeabilizzazione dopo l'ultracriosezione. La perossidasi di rafano (HRP) è anche un tag sensibile che catalizza la polimerizzazione dipendente da DAB H2O2in un precipitato localizzato, fornendo contrasto EM dopo il trattamento con OsO4. La sequenza di peptidi bersaglio ER HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)12 è stata applicata per visualizzare ER all'interno di un'intera cellula. Per valutare il nostro protocollo di utilizzo di tag genetici e di attenuazione in blocco con osmio ridotto e TCH (metodo rOTO), utilizzando l'effetto osmicazione allo stesso tempo, abbiamo confrontato il contrasto della membrana con e senza l'uso di ogni tag genetico in rOTO en bloc colorazione. Anche se 3DEM con tomografia array e colorazione DAB con APEX e HRP sono stati, rispettivamente, utilizzati per altri scopi, il nostro protocollo è unico perché abbiamo combinato la tomografia di array per la colorazione 3DEM e DAB per la colorazione dei mitocondri e del ER. In particolare, abbiamo mostrato cinque cellule con e senza geni etichettati con APEX nella stessa sezione, il che ha aiutato a studiare l'effetto della modificazione genetica sulle cellule.
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Protocol
1. Coltura cellulare con piatto di coltura della griglia modellato e trasfezione cellulare con SCO1-APEX2 e vettore plasmid HRP-KDEL
- Seme 1 x 105 cellule HEK293T mettendole in piatti di coltura con fondo griglia in vetro da 35 mm in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 a 37 gradi centigradi nel mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) integrato con 10% siero bovino fetale, 100 U/mL penicillina e 100 U/mL streptomycin.
- Il giorno dopo la semina delle cellule, quando sono cresciute al 50%-60% di confluenza, introdurre il SCO1-APEX210 e HRP-KDEL12 plasmide alle cellule utilizzando reagente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore (SCO1-APEX2 cDNA 0,5 g DNA plasmide HRP-KDEL 0,5 g per 3 reagente di trasfezione).
2. Microscopia leggera delle cellule che crescono su piatti a coltura modellata e colorazione DAB per APEX2 e HRP
- A 16-24 h dopo la trasfezione, rimuovere tutti i supporti di coltura e aggiungere immediatamente 250 l di soluzione di fissaggio calda (30-37 gradi centigradi) (Tabella 1) mediante un delicato pipettaggio. Rimuovere immediatamente la soluzione di fissaggio e sostituirla con 1,5 mL di soluzione di fissaggio nuova. Incubare sul ghiaccio per 60 min, quindi lavare tre volte per 10 min ciascuno in 1 mL di ghiaccio freddo tamponi cacodylate (Tabella 1).
AVVISO: i fumi di aldeide sono estremamente tossici. Eseguire tutto il lavoro sotto una cappa di fumi ventilata. - Aggiungere 1 mL di soluzione di glicina da 20 mM e incubare per 10 min sul ghiaccio seguito da tre lavatrici di 5 min ciascuno in 1 mL di tampone freddo di cacodilate di sodio.
- Preparare una soluzione DAB fresca 1x (3,33 mL di soluzione cacodylate da 0,3 M: 10 -L del 30% H2O2 - 5,67 mL di acqua fredda - 1 mL 10x soluzione DAB).
- Aggiungere 500 l della soluzione DAB 1x appena preparata (passaggio 2.3) e incubare sul ghiaccio per circa 5-45 min fino a quando una macchia marrone chiaro è visibile sotto un microscopio luminoso invertito (Figura 1A).
- Rimuovere delicatamente la soluzione DAB e risciacquare tre volte con 1 mL di tampone freddo di cacodialato di sodio per 10 min ciascuno.
- Utilizzare un microscopio invertito a contrasto di fase (o un microscopio luminoso a campo luminoso) per visualizzare la colorazione DAB a un ingrandimento di 100x o superiore. Utilizzare una penna marker per contrassegnare la parte inferiore del vetro in cui si trova l'area di interesse (ROI) (Figura 1B,C).
3. Preparazione del campione per il blocco EM
- Eseguire la coltura cellulare e la colorazione DAB come descritto nei passaggi 2.1-2.6.
- Dopo aver fissato i campioni con 1 mL del 2% ridotto OsO4 per 1 h a 4 gradi centigradi.
AVVISO: i fumi OsO4 sono altamente tossici. Eseguire tutto il lavoro sotto una cappa di fumi ventilata. - Preparare una nuova soluzione TCH (Tabella 1) durante il passaggio 3.2 e passare attraverso un filtro 0,22 m.
AVVISO: i fumi TCH sono altamente tossici. Eseguire tutto il lavoro sotto una cappa di fumi ventilata. - Rimuovere il fissativo e risciacquare tre volte con 1 mL di acqua distillata per 5 min ciascuno a temperatura ambiente (RT).
- Posizionare le cellule in 1 mL di soluzione TCH precedentemente preparata e filtrata per 20 min in RT.
- Sciacquare le cellule tre volte con 1 mL di acqua distillata per 5 min ciascuna a RT.
- Esporre le cellule una seconda volta a 1 mL di 2% tetrossido di osmio in acqua distillata per 30 min a RT.
- Rimuovere il fissativo e risciacquare tre volte con 1 mL di acqua distillata per 5 min ciascuno a RT. Aggiungere 1 mL di 1% acetato di uranilo (acquoso), e lasciare peruna durante la notte a 4 gradi centigradi al buio.
- Lavare le cellule tre volte in 1 mL di acqua distillata per 5 min ciascuno a RT.
- Preriscaldare la soluzione di aspartazione di piombo di Walton (Tabella 1) in forno a 60 gradi centigradi per 30 min.
- Macchiare le cellule con la soluzione di aspartate di piombo di Walton aggiungendo 1 mL della soluzione di aspartazione di piombo preriscaldato, e poi mettere in forno per 30 min a 60 gradi centigradi.
- Sciacquare le cellule tre volte con 1 mL di acqua distillata per 5 min ciascuna a RT.
- Incubare in una serie graduata di 2-mL di etanoli (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) per 20 min ciascuno a RT.
- Decantare l'etanolo e incubare per 30 min in 1 mL di 3:1 etanolo:low-viscosity incorporando miscela media a RT.
- Rimuovere il mezzo e aggiungere 1 mL di 1:1 etanolo: basso-viscosità incorporando mezzo miscela. Incubare per 30 min a RT.
- Rimuovere il mezzo e aggiungere 1 mL di 1:3 etanolo:low-viscosity incorporando mezzo miscela. Incubare per 30 min a RT.
- Rimuovere il mezzo e aggiungere 1 mL di 100% a bassa viscosità incorporando il mezzo e incubare durante la notte.
- Incorporare il campione in miscela di incorporamento a bassa viscosità al 100% e incubare per 24 h a 60 gradi centigradi.
- Preparare sezioni spesse 90 nm utilizzando un ultramicrotome.
- Osservare la griglia in TEM a 200 kV.
4. Sezionamento e montaggio seriale su coperchi rivestiti indio-tin-ossido per l'imaging SEM
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Preparazione del substrato
- Pulire il vetro indium-tin-oxide (ITO)-rivestito di coperturalabbra (22 mm x 22 mm) da agitazione delicata in isopropanol per 30-60 s.
- Rimuovere i copricopertine, scolare l'isopropanolo in eccesso e lasciare in un ambiente privo di polvere fino a quando non è asciutto.
- Trattare i coperchi in vetro rivestito ITO con una scarica di bagliore utilizzando un rivestimento al plasma per 1 min.
NOTA: L'attivazione del plasma conferisce una proprietà idrofila sulla superficie del substrato. Crea una pellicola d'acqua molto sottile sul substrato per prevenire la formazione di rughe nelle sezioni quando la sezione è attaccata al substrato. - Inserire i coperchi in vetro rivestito ITO nel supporto del substrato e posizionarli nella barca del coltello.
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Taglio del blocco campione e sezionamento seriale
- Inserire il blocco campione nel supporto campione dell'ultramicrotoma e impostarlo nel blocco di rifilatura.
- Utilizzare una lama di rasoio per tagliare via tutta la resina in eccesso intorno alla posizione di destinazione (identificata nel passaggio 2.6, Figura 1D-G). La forma del quadrante del blocco deve essere trapezioo o rettangolare. Il bordo iniziale e il bordo finale devono essere assolutamente paralleli (Figura 1H,I).
- Inserire il supporto del campione sul braccio dell'ultramicrotoma e posizionare il coltello di diamante nel supporto del coltello. Inserire i coperchi del vetro ITO nel supporto nastro e bloccare il supporto con la maniglia (Figura 1J). Impostare il nastro portante nella barca coltello e riempire la barca coltello con acqua distillata filtrata (Figura 1K).
- Regolare la posizione del supporto con la diapositiva del coltello spingendo con attenzione la maniglia del supporto per impostare il bordo del vetro ITO vicino al coltello (Figura 1L).
- Dopo aver tagliato la sezione, interrompere il processo di sezionamento e aprire lentamente la vite di bloccaggio del tubo e drenare la barca ad acqua (velocità di flusso di una goccia d'acqua al secondo).
- Dopo aver completato il processo di raccolta del nastro, rimuovere il substrato con il manico del dispositivo di bloccaggio e asciugare il nastro (Figura 1M).
5. Imaging nel SEM e allineamento dello stack di immagini SEM
- Montare il coperchio rivestito ITO su mozziconi di alluminio con nastro adesivo in carbonio. Sigillare la superficie di vetro e la superficie nello stub con nastro adesivo in carbonio, quindi rivestire con uno strato di carbonio spesso 10 nm (Figura 1N).
- Osservare lo coverslip rivestito ITO in un SEM a emissione di campo a una bassa tensione di accelerazione di 5 kV e una distanza di lavoro adeguata per la raccolta efficiente di BSE.
- Importare le immagini seriali nel software Image J (Fiji)13 utilizzando l'opzione di stack virtuale. Aprire un nuovo TrakEM14e importare lo stack di immagini in TrakEM. Fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere il menu di allineamento.
- Quindi selezionare l'intervallo di immagini (dalla prima immagine all'ultima immagine). Completare l'allineamento automatico, salvare il set di dati allineato e scegliere Esporta per compilare un'immagine piatta dall'intervallo di immagini selezionato (dalla prima immagine all'ultima immagine). Infine, salvate i dati dell'immagine piatta in formato AVI nel menu principale Immagine J.
NOTA: Filmato supplementare 1 e Filmato supplementare 2 mostrano rispettivamente la pila di immagini SEM e la pila di immagini ritagliate.
6. Segmentazione dei mitocondri ed ER da immagini seriali
- Avviare il 3dmod nel software IMOD15 e aprire i file di immagine.
- Nella finestra di ap, disegnare il contorno dei mitocondri e del ER utilizzando il pulsante centrale del mouse.
- Per visualizzare il volume segmentato, aprire la finestra Vista modello (Filmatosupplementare 3 ).
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Representative Results
Nella Figura 1 vengono descritti la pianificazione e il flusso di lavoro per questo protocollo. Il protocollo richiede 7 giorni; tuttavia, a seconda del tempo dedicato all'imaging SEM, questo può aumentare. Per la trafezione cellulare, la confluenza delle cellule deve essere controllata in modo da non coprire la parte inferiore dell'intera piastra della griglia (Figura 1A). Un'alta densità cellulare potrebbe impedire l'identificazione della cellula di interesse durante il microscopio leggero e l'osservazione EM. Abbiamo usato plasmidi geneticamente etichettati che esprimevano APEX2 e HRP per selezionare cellule trasfettate in modo efficiente tra le numerose cellule coltivate nel piatto di coltura. Abbiamo coltivato cellule HEK293T e confermato l'espressione di APEX2 collegato a SCO1 (spazio intermembrano mitocondriale [IMS]) e KDEL coniugato HRP (ER) in cellule co-transinfettate. Sotto microscopia leggera, le cellule trasfette APEX2 sono state macchiate di un colore marrone, mentre le cellule senza trasfezione sono rimaste incontaminate (Figura1A e Figura 2). Ciò ha permesso l'identificazione delle cellule bersaglio transinfettate, che sono state poi utilizzate per la microscopia elettronica correlata (CLEM), utilizzando la colorazione DAB in una popolazione di cellule coltivate (Figura 3D-F e Figura 4B). È stato utile contrassegnare il fondo di vetro (Figura 1B,C) per semplificare l'identificazione della posizione della cella di destinazione durante la fase di incorporamento piatto (Figura 1E,F). Quando le cellule HEK293T sono state trattate con un protocollo di colorazione "doppio osmio" avanzato (rOTO), intere cellule sono state macchiate di un colore scuro (Figura 1D). Dopo aver rimosso il coperchio grigliato dal piatto di coltura, abbiamo identificato la posizione di destinazione sulla superficie del blocco sotto un microscopio stereo (Figura 1G). Abbiamo tagliato le celle nel ROI in una forma trapezio e i bordi iniziali e finali sono stati resi paralleli (Figura 1H,I). Per implementare la ricostruzione di mitocondri e rete ER, abbiamo usato un grande coltello a diamante con una grande barca ad acqua per sezione seriale SCO1-APEX2 e HRP-KDEL-esprimendo le cellule HEK293T (Figura 1J-L). Le sezioni seriali di spessore del nastro di 90 nm sono state collegate correttamente allo slip in vetro rivestito ITO (Figura 1M) e la superficie è stata rivestita con carbonio spesso 10 nm per l'osservazione tramite SEM (Figura 1N).
Le proteine SCO1-APEX2 e HRP-KDEL generano segnali elettronici molto densi derivati dalla conversione DAB rilevabili in TEM (Figura 3) e SEM (Figura 4). La macchia scura generata da SCO1-APEX2 è stata osservata esclusivamente nell'IMS e non nello spazio della matrice dei mitocondri (Figura 3D). Le cellule co-trascate (la cellula sinistra nella figura 3D,E) con plasmide SCO1-APEX2 e HRP-KDEL hanno espresso un segnale di elettroni ad alta densità in Mitocondriale IMS ed ER; tuttavia, non abbiamo osservato alcuna colorazione ER nelle cellule che sono state trascate solo con SCO1-APEX2 (la cella destra nella figura 3D, F). Per le immagini seriali che utilizzano SEM, in primo luogo, abbiamo creato una panoramica dell'intera immagine dell'array utilizzando il rilevatore BSE su un'ampia area (Figura 4A). In secondo luogo, il ROI è stato inserito nella prima sezione e propagato a tutte le altre sezioni (Figura 4B). Infine, è stato visualizzato il ROI contenente cinque celle di destinazione con pixel immagine di 5 nm (Figura 4C). Le immagini ingrandite hanno rivelato strutture subcellulari dettagliate (Figura 4D) come l'apparato Golgi, i mitocondri, i nuclei e il ER. Le immagini seriali mostravano chiaramente che i contatti ER-mitocondri si verificavano su diversi piani z ( Film supplementare2 e Filmsupplementare 3).
Figura 1 : S ampio flusso di lavoro di preparazione per SEM e TEM. (A) Un piatto di coltura contenente coverlips grigliati era seminato con cellule e macchiato di DAB. (B,C) Dopo la colorazione DAB, è stata utilizzata una penna per segnare il fondo del vetro in cui si trovavano le celle di destinazione. (D) Dopo OsO4 colorazione, le cellule diventano un colore scuro. (E, F) Tubi a catena polimerasi (PCR) (o qualsiasi tipo di capsule di incorporamento) sono stati utilizzati per creare facilmente un blocco EM che conteneva le posizioni contrassegnate. (E) Vista dall'alto. (F) Vista inferiore. (G) Un'immagine di microscopia stereo a basso ingrandimento della superficie di un blocco EM. (H) Il ROI è al centro della superficie piana. (I) Un'immagine di microscopia stereo ad ingrandimento più elevato del ROI rettangolare. (J) I pannelli in vetro rivestito ITO (asterisco bianco) vengono inseriti nel supporto nastro (freccia blu) e il supporto viene bloccato ruotando la maniglia in senso orario. (K, L) Il manico del supporto viene premuto con attenzione e il supporto viene regolato per posizionare il bordo della copertura di vetro rivestita ITO vicino al coltello scivolando. (M) I nastri sono attaccati ai coperchi in vetro rivestito ITO. (N) I copricapi in vetro rivestiti ITO sono attaccati ai mozziconi SEM e il vetro residuo è sigillato con nastro adesivo in carbonio e rivestito con uno strato di filo di carbonio di 10 nm. Gli asterischi bianchi indicano la vetrina in vetro rivestita ITO, mentre gli asterischi neri indicano il nastro di carbonio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagine di microscopia a contrasto di fase invertita delle cellule HEK293T coltivate macchiate con DAB. (A) Colorazione delle cellule con solo DAB (senza colorazione OsO4). Le frecce bianche indicano le celle incontaminate, e le frecce nere indicano le celle macchiate DAB. (B) Immagine di ingrandimento superiore del ROI. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : immagini TEM di cellule HEK293T che presentano i mitocondri al tempo stesso IMS (SCO1-APEX2) e ER (HRP-KDEL). (A-C) Cellule HEK293T non trastrafette che mostrano la doppia membrana dei mitocondri (M) e dell'endoplasmic a reticolo (ER). (D-F) APEX2 e HRP catalizzano la polimerizzazione del DAB in un precipitato locale, che viene successivamente macchiato con OsO4ad alta densità di elettroni. Un contrasto scuro è evidente nell'IMS mitocondriale (freccia nera) e nel ER (freccia nera); tuttavia, le cellule che non sono state trasinate con HRP-KDEL presentano ER incontaminato (freccia bianca). Barre di scala: 1 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Imaging SEM seriale di cellule HEK293T che presentano i mitocondriali mirate IMS (SCO1-APEX2) ed ER (HRP-KDEL). (A) Panoramica dei nastri di sezione seriale osservati mediante il rilevatore BSE. (B) Correlazione dell'immagine a basso ingrandimento (inset) con immagine BSE ad ingrandimento elevato (la casella tratteggiata bianca indica il ROI delle celle macchiate DAB). (C) Ingrandimento elevato delle celle di destinazione del ROI con pixel immagine di 5 nm. (D,E) Un contrasto scuro è evidente nell'IMS mitocondriale e nel ER, ma non nell'apparato di Golgi. (F-I) I contatti ER-mitocondri (freccia bianca) si verificano su diversi piani z. N, nucleo; M, mitocondri; ER, reticolo endoplasmico; G, apparato Golgi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Ricette di soluzione.
Filmato supplementare 1: stack di immagini SEM. Fiji13 con il software TrakEM14 è stato utilizzato per allineare 91 immagini. Il set di dati allineato originale è 11 GB. Per eseguire il downsize della pila, è stato utilizzato il set di immagini ridimensionate e ritagliate. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Filmato supplementare 2: pila di immagini ritagliate. Per visualizzare in dettaglio i mitocondri, il pronto accesso al pronto recapito e i relativi siti di contatto, le immagini sono state ritagliate dal set di dati originale (5 nm/pixel). Barre della scala: 1 m. Fare clic qui per visualizzare questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
Film supplementare 3: Ricostruzione 3D dei mitocondri e del ER. Per la visualizzazione 3D, il contorno dei mitocondri e del ER è stato segmentato e visualizzato utilizzando il software IMOD15. I mitocondri sono stati visualizzati come lunghe strutture tubolari (rosso), e le reti ER (verde) hanno mostrato la loro complicata morfologia. Giallo rappresentava una vasta superficie di sito di contatto tra mitocondri e ER in diversi piani z. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)
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Discussion
Determinare la localizzazione cellulare di proteine specifiche a risoluzione di nanometri utilizzando EM è fondamentale per comprendere le funzioni cellulari delle proteine. In generale, ci sono due tecniche per studiare la localizzazione di una proteina bersaglio tramite EM. Una è la tecnica dell'immunogolda, che è stata utilizzata in EM dal 1960, e l'altra è una tecnica che utilizza tag geneticamente codificati di recente16. Le tecniche tradizionali di immunogold hanno impiegato particelle d'oro coniugate ad anticorpi o punti quantici per mostrare la posizione della proteina etichettata. Tuttavia, a causa della necessità di anticorpi di alta qualità e dell'efficienza di penetrazione degli anticorpi affetti da resina e fissativo, questa tecnica è significativamente limitata17. In particolare, poiché l'etichettatura dell'immunogoldgold è prevalentemente limitata alla superficie di una sezione ultrasottile senza colorazione metallica en bloc e forte fissazione dell'osmio, questa tecnica non è direttamente applicabile al moderno 3DEM18. Per utilizzare i metodi 3DEM recenti, tra cui SBEM e la tomografia array, con l'etichettatura delle proteine, abbiamo utilizzato tag EM codificati geneticamente in questo protocollo. I tag codificati geneticamente non richiedono la permeabilizzazione, l'ultraclorosezione tecnicamente esigente e l'immunostainizzazione delle singole sezioni perché si localizzano nel sito di interesse prima della fissazione.
Le procedure per la preparazione dei campioni in 3DEM includono generalmente una combinazione di metodi comuni di fissazione chimica e colorazione dei metalli pesanti, poiché le cellule sono composte principalmente da C, H, O e N, che richiedono una colorazione con metalli pesanti per acquisire contrasto ai sensi dell'EM9 . Pertanto, abbiamo impiegato una fissazione ridotta dell'osmio e la colorazione dei metalli per migliorare il contrasto e la conduttività per l'imaging seriale. La procedura per colorare i campioni prima della sezionamento, nota come colorazione en bloc, è stata riportata come un passo essenziale per i metodi 3DEM come SBEM e FIB-SEM19. Abbiamo confermato che le celle in blocco-colorato nel nostro protocollo dimostrato chiaro SCO1-APEX2 e HRP-KDEL EM contrasto esclusivamente nel mitocondriale IMS ed ER, rispettivamente, in TEM (Figura 3). Inoltre, le immagini SEM delle sezioni seriali 90 nm hanno rivelato un netto contrasto in entrambi gli organelli (Figura 4). In particolare, il contrasto migliorato per colorazione in blocco era nettamente distinguibile dal segnale DAB, e il contrasto e la conduttività hanno portato a immagini seriali di buona qualità (Figura 4). Inoltre, questo contrasto elevato facilita le attività successive come l'allineamento e la segmentazione con software di immagine tridimensionale (3D).
Negli ultimi anni, le tecniche di microscopia elettronica a volume (dik-SBEM, FIB-SEM e tomografia array) hanno risposto a domande biologiche che richiedevano l'osservazione di un ampio campo visivo e di una vista 3D. Dik-SBEM e FIB-SEM non comportano la gestione fisica delle sezioni, quindi è possibile ridurre il tempo per l'allineamento delle immagini. Tuttavia, il campione deve essere distrutto per ottenere immagini seriali e il campo visivo è più piccolo di quello della tomografia a matrice. L'imaging SEM seriale che utilizza la tomografia a matrice è sempre più utilizzato come alternativa al sezionamento seriale TEM, e il principale vantaggio di questa tecnica è il suo modo non distruttivo e ampio campo visivo. A differenza di altre tecniche 3DEM come dik-SBEM e FIB-SEM, le sezioni possono essere memorizzate su una copertina, una copertina rivestita ITO, un wafer di silicio o un nastro e possono essere ripetutamente immagini7.
APEX2 è facile da usare e può dare una vasta gamma di densità di colorazione senza attrezzature speciali, a differenza del mini generatore di ossigeno singlet20 o delle tecniche di proteina fluorescente21, generando precipitazioni DAB tramite una fotoossidazione. La sua applicazione variabile è stata testata in diversi organelli cellulari tra cui nucleo, membrana plasmatica, matrice mitocondriale, cristae mitocondriale, ER, tubulina e actina in COS 7 e HEK293T cellula22. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni e diversi punti di controllo per l'uso di tag geneticamente codificati nelle micrografie elettroniche. I livelli di espressione dei geni esogeni devono essere controllati per ottenere una colorazione ragionevole a livello di EM, perché se l'espressione del tag genetico è troppo alta, può indurre segnali falsi positivi e perturbare l'ultrastruttura delle cellule attraverso la rottura della membrana e l'aggregazione di organelli subcellulari23. Un altro possibile problema è DAB overstaining, che è stato segnalato per causare sfocatura e distruzione della membrana22. Per garantire l'espressione appropriata dei geni, le cellule macchiate di DAB sono state confrontate con cellule non colorate utilizzando sia la microscopia leggera che la definizione di dati (Figura2 e Figura 3). Inoltre, il livello di fissazione dovrebbe essere ben regolato per garantire che le ossidi endogene siano completamente inattive. Per evitare che eventuali artefatti di ossidesi endogeni durante la lavorazione, abbiamo fissato un monostrato di cellule invece di utilizzare celle staccate e pellete24. Questo ha anche aiutato a identificare le cellule di interesse quando abbiamo controllato il segnale DAB in microscopia leggera. Pertanto, i risultati indicano che la colorazione e la fissazione dei monostrati cellulari sono utili per CLEM utilizzando la colorazione DAB (Figura 2). Le immagini seriali con tomografia a matrice e modello 3D hanno rivelato che i siti di contatto ER-mitocondri si verificano su diversi piani z ( Film supplementare2 e Film supplementare 3). L'immagine produce una visualizzazione 3D completa delle reti mitocondriali ed ER in celle intere ( Film supplementare1). Suggerisce che l'analisi del volume 3D è essenziale per il confronto quantitativo dei contatti ER-mitocondri. Quando si studiano le reti complesse di organelli intracellulari, questa è una tecnica eccezionalmente utile.
In conclusione, questo protocollo era un'efficace combinazione di tecniche CLEM e 3DEM che permetteva un'indagine su interi cellulari a livello EM. In particolare, due tag diversi allo stesso tempo e i segnali DAB in due organelli diversi erano visibili in un'intera cellula. Inoltre, le celle etichettate e le celle senza etichetta nella stessa sezione possono essere confrontate, a causa di EM su larga scala. In questo protocollo, la colorazione in blocco e i segnali DAB provenienti da tag geneticamente codificati sono stati utili per studiare l'interazione tra organelli membranosi in cellule intere. Questa potrebbe essere un'applicazione adatta per EM su larga scala per studiare altre interazioni cellulari.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca di base KBRI attraverso il Korea Brain Research Institute finanziato dal Ministero della Scienza e ICT (19-BR-01-08), e dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT)(No. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 e HRP-KDEL plasmids sono stati gentilmente forniti da Hyun-Woo Rhee (Seoul National University). I dati TEM sono stati acquisiti presso Brain Research Core Facilities in KBRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | Use only in fume hood |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | Use only in fume hood |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 4 % aqueous solution | EMS | 16320 | Use only in fume hood |
| Epon 812 | EMS | 14120 | EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml |
| Ultra-microtome Leica ARTOS 3D | Leica | ARTOS 3D | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| 35mm Gridded coverslip dish | Mattek | P35G-1.5-14-CGRD | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| Formvar carbon coated Copper Grid | Ted Pella | 01805-F | |
| Hydrochloric acid | SIGMA | 258148 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Glycine | SIGMA | G8898 | |
| 3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) | SIGMA | D8001 | Hazardous chemical |
| 30% Hydrogen peroxide solution | Merck | 107210 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | SIGMA | P3289 | |
| 0.22 um syringe filter | Sartorius | 16534 | |
| Thiocarbonyldihydrazide | SIGMA | 223220 | Use only in fume hood |
| Potassium hydroxide | Fluka | 10193426 | |
| L-aspartic acid | SIGMA | A9256 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips | SPI | 06489-AB | fragil glass |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP2618-1 | |
| Diamond knife | Leica | AT-4 | |
| Inveted light microscopy | Nikon | ECLipse TS100 | |
| Scanning electron microscopy | Zeiss | Auriga |
References
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