Vi presenterer en protokoll for å studere fordelingen av mitokondrier og endoplasmatiske retikulum i hele celler etter genetisk modifisering ved hjelp av correlative lys og volum elektron mikroskopi inkludert ascorbate peroksidase 2 og pepperrot peroksidase farging, seriell snitting av celler med og uten mål genet i samme avsnitt, og seriell avbildning via elektron mikroskopi.
Mobil organeller, for eksempel mitokondrier og endoplasmatiske retikulum (ER), oppretter et nettverk for å utføre en rekke funksjoner. Disse svært buede strukturer er foldet inn i ulike former for å danne et dynamisk nettverk avhengig av cellulære forhold. Visualisering av dette nettverket mellom mitokondrier og ER har blitt forsøkt å bruke super-oppløsning fluorescens Imaging og lys mikroskopi; den begrensede oppløsningen er imidlertid utilstrekkelig for å observere membraner mellom mitokondrier og ER i detalj. Transmission Electron mikroskopi gir god membran kontrast og nanometer-skala oppløsning for observasjon av cellulære organeller; Det er imidlertid svært tidkrevende når man vurderer den tredimensjonale (3D) strukturen til svært buede organeller. Derfor observerte vi morfologi av mitokondrier og ER via correlative lys-elektron mikroskopi (CLEM) og volum elektron mikroskopi teknikker ved hjelp av forbedret ascorbate peroksidase 2 og pepperrot peroksidase farging. En en blokk Fargemetode, super tynn seriell snitting (array tomografi) og volum elektron mikroskopi ble brukt for å observere 3D-strukturen. I denne protokollen, foreslår vi en kombinasjon av CLEM og 3D elektron mikroskopi for å utføre detaljerte strukturelle studier av mitokondrier og ER.
Mitokondrier og endoplasmatiske retikulum (er) er membran bundet cellulær organeller. Deres forbindelse er nødvendig for deres funksjon, og proteiner knyttet til deres nettverk har blitt beskrevet1. Avstanden mellom mitokondrier og ER har blitt rapportert som ca 100 NM ved hjelp av lys mikroskopi2; men nyere super-oppløsning mikroskopi3 og elektron MIKROSKOPI (EM)4 studier har avdekket det å være betydelig mindre, på ca 10-25 NM. Oppløsningen oppnådd i super-oppløsning mikroskopi er lavere enn EM, og spesifikke merking er nødvendig. EM er en egnet teknikk for å oppnå en tilstrekkelig høyoppløsnings kontrast for strukturelle studier av forbindelsene mellom mitokondrier og AKUTTEN. En ulempe er imidlertid den begrensede informasjonen for z-aksen fordi de tynne seksjonene må være omtrent 60 nm eller tynnere for konvensjonelle overførings elektron mikroskopi (TEM). For tilstrekkelig EM z-akse Imaging, tredimensjonale elektron mikroskopi (3DEM) kan brukes5. Men dette innebærer utarbeidelse av hundrevis av tynne serielle deler av hele celler, noe som er veldig vanskelig arbeid som bare noen få dyktige teknologer har mestret. Disse tynne seksjoner er samlet på skjøre formbar film-belagt ett hull TEM nett. Hvis filmen bryter på en bind omkring, seriell bildebehandling og volum rekonstruksjon er ikke mulig. Seriell blokk-ansikt skanning elektron mikroskopi (SBEM) er en populær teknikk for 3DEM som bruker destruktive en blokk snitting inne i skanning elektronmikroskop (SEM) vakuum kammer med enten en diamant kniv (dik-SBEM) eller en fokusert ion bjelke (LØGN-SEM) 6. men fordi disse teknikkene er ikke tilgjengelig på alle fasiliteter, foreslår vi array tomografi7 bruker SERIELL snitting og SEM. I array tomografi, seriell seksjoner kuttet ved hjelp av en ultramicrotome overføres til et glass dekkglass i stedet for en TEM rutenett og visualisere via lys mikroskopi og SEM8. For å forsterke signalet for Backscatter elektron (BSE), benyttet vi en Osmium-EM fargeprotokoll som sysselsetter tetroxide (OsO4)-faste celler med osmiophilic THIOCARBOHYDRAZIDE (TCH)9, slik at vi kan få bilder uten dobbel farging etter innebygging.
I tillegg mitokondrie markør SCO1 (cytokrom c oksidase montering protein 1)-ascorbate peroksidase 2 (APEX2)10 molekylær tag ble brukt til å visualisere MITOKONDRIER på EM nivå. APEX2 er ca. 28 kDa og er avledet fra Soyabønne ascorbate peroksidase11. Den ble utviklet for å vise detaljert plassering av spesifikke proteiner på EM nivå på samme måte som grønne fluorescerende protein-Tagged protein brukes i lys mikroskopi. APEX2 konverterer 3, 3 ‘-diaminobenzidine (DAB) til et uløselig osmiophilic polymer på stedet av koden i nærvær av kofaktor hydrogen peroxide (H2O2). APEX2 kan brukes som et alternativ til tradisjonelle antistoff merking i EM, med et protein lokalisering gjennom dybden av hele cellen. Med andre ord, det APEX2-merket protein kan visualisere etter spesifikk osmication11 uten immunogold merking og permeabilization etter ultra-kryosnitt. Pepperrot peroksidase (HRP) er også en følsom kode som katalyserer H2O2-avhengige polymerisering av DAB inn i en lokalisert UTFELLING, og gir dem kontrast etter behandling med OsO4. Er-målet peptid sekvens HRP-KDEL (lys-ASP-Glu-leu)12 ble brukt til å visualisere er i en hel celle. For å evaluere vår protokoll for å utnytte genetiske koder og en blokk farging med redusert Osmium og TCH (rOTO-metoden), ved hjelp av osmication effekt på samme tid, sammenlignet vi membranen kontrast med og uten bruk av hver genetisk kode i rOTO en Bloc farging. Selv om 3DEM med array-tomografi og DAB-farging med APEX og HRP har henholdsvis blitt benyttet til andre formål, er protokollen vår unik fordi vi har kombinert array-tomografi for 3DEM og DAB-farging for mitokondrier og ER-merking. Nærmere bestemt viste vi fem celler med og uten APEX-Tagged gener i samme avsnitt, som hjalp i å undersøke effekten av genetisk modifisering på celler.
Bestemme mobilnettet lokalisering av spesifikke proteiner på en nanometer oppløsning ved hjelp av EM er avgjørende for å forstå cellulære funksjoner av proteiner. Vanligvis er det to teknikker for å studere lokalisering av et mål protein via EM. Den ene er immunogold teknikk, som har vært brukt i EM siden 1960, og den andre er en teknikk som bruker nylig utviklede genetisk kodede koder16. Tradisjonelle immunogold teknikker har brukt antistoff-bøyd gull partikler eller Quantum prikker for…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av KBRI grunnleggende forskningsprogram gjennom Korea Brain Research Institute finansiert av departementet for vitenskap og IKT (19-BR-01-08), og National Research Foundation of Korea (NRF) Grant finansiert av Korea-regjeringen (MSIT) (nr. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 og HRP-KDEL plasmider var vennlig levert av Hyun-Woo Rhee (Seoul National University). TEM data ble anskaffet ved Brain Research Core fasiliteter i KBRI.
Glutaraldehyde | EMS | 16200 | Use only in fume hood |
Paraformaldehyde | EMS | 19210 | Use only in fume hood |
Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
Osmium tetroxide 4 % aqueous solution | EMS | 16320 | Use only in fume hood |
Epon 812 | EMS | 14120 | EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 – 0.8 ml |
Ultra-microtome Leica ARTOS 3D | Leica | ARTOS 3D | |
Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
Lead citrate | EMS | 17900 | |
35mm Gridded coverslip dish | Mattek | P35G-1.5-14-CGRD | |
Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
Formvar carbon coated Copper Grid | Ted Pella | 01805-F | |
Hydrochloric acid | SIGMA | 258148 | |
Fugene HD | Promega | E2311 | |
Glycine | SIGMA | G8898 | |
3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) | SIGMA | D8001 | Hazardous chemical |
30% Hydrogen peroxide solution | Merck | 107210 | |
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | SIGMA | P3289 | |
0.22 um syringe filter | Sartorius | 16534 | |
Thiocarbonyldihydrazide | SIGMA | 223220 | Use only in fume hood |
Potassium hydroxide | Fluka | 10193426 | |
L-aspartic acid | SIGMA | A9256 | |
Ethanol | Merck | 100983 | |
Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 | |
Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips | SPI | 06489-AB | fragil glass |
Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP2618-1 | |
Diamond knife | Leica | AT-4 | |
Inveted light microscopy | Nikon | ECLipse TS100 | |
Scanning electron microscopy | Zeiss | Auriga |