Mitokondrier og endoplasmatiske retikulum Imaging av correlative Light og Volume Electron mikroskopi

Summary

Vi presenterer en protokoll for å studere fordelingen av mitokondrier og endoplasmatiske retikulum i hele celler etter genetisk modifisering ved hjelp av correlative lys og volum elektron mikroskopi inkludert ascorbate peroksidase 2 og pepperrot peroksidase farging, seriell snitting av celler med og uten mål genet i samme avsnitt, og seriell avbildning via elektron mikroskopi.

Abstract

Mobil organeller, for eksempel mitokondrier og endoplasmatiske retikulum (ER), oppretter et nettverk for å utføre en rekke funksjoner. Disse svært buede strukturer er foldet inn i ulike former for å danne et dynamisk nettverk avhengig av cellulære forhold. Visualisering av dette nettverket mellom mitokondrier og ER har blitt forsøkt å bruke super-oppløsning fluorescens Imaging og lys mikroskopi; den begrensede oppløsningen er imidlertid utilstrekkelig for å observere membraner mellom mitokondrier og ER i detalj. Transmission Electron mikroskopi gir god membran kontrast og nanometer-skala oppløsning for observasjon av cellulære organeller; Det er imidlertid svært tidkrevende når man vurderer den tredimensjonale (3D) strukturen til svært buede organeller. Derfor observerte vi morfologi av mitokondrier og ER via correlative lys-elektron mikroskopi (CLEM) og volum elektron mikroskopi teknikker ved hjelp av forbedret ascorbate peroksidase 2 og pepperrot peroksidase farging. En en blokk Fargemetode, super tynn seriell snitting (array tomografi) og volum elektron mikroskopi ble brukt for å observere 3D-strukturen. I denne protokollen, foreslår vi en kombinasjon av CLEM og 3D elektron mikroskopi for å utføre detaljerte strukturelle studier av mitokondrier og ER.

Introduction

Mitokondrier og endoplasmatiske retikulum (er) er membran bundet cellulær organeller. Deres forbindelse er nødvendig for deres funksjon, og proteiner knyttet til deres nettverk har blitt beskrevet¹. Avstanden mellom mitokondrier og ER har blitt rapportert som ca 100 NM ved hjelp av lys mikroskopi²; men nyere super-oppløsning mikroskopi³ og elektron MIKROSKOPI (EM)⁴ studier har avdekket det å være betydelig mindre, på ca 10-25 NM. Oppløsningen oppnådd i super-oppløsning mikroskopi er lavere enn EM, og spesifikke merking er nødvendig. EM er en egnet teknikk for å oppnå en tilstrekkelig høyoppløsnings kontrast for strukturelle studier av forbindelsene mellom mitokondrier og AKUTTEN. En ulempe er imidlertid den begrensede informasjonen for z-aksen fordi de tynne seksjonene må være omtrent 60 nm eller tynnere for konvensjonelle overførings elektron mikroskopi (TEM). For tilstrekkelig EM z-akse Imaging, tredimensjonale elektron mikroskopi (3DEM) kan brukes⁵. Men dette innebærer utarbeidelse av hundrevis av tynne serielle deler av hele celler, noe som er veldig vanskelig arbeid som bare noen få dyktige teknologer har mestret. Disse tynne seksjoner er samlet på skjøre formbar film-belagt ett hull TEM nett. Hvis filmen bryter på en bind omkring, seriell bildebehandling og volum rekonstruksjon er ikke mulig. Seriell blokk-ansikt skanning elektron mikroskopi (SBEM) er en populær teknikk for 3DEM som bruker destruktive en blokk snitting inne i skanning elektronmikroskop (SEM) vakuum kammer med enten en diamant kniv (dik-SBEM) eller en fokusert ion bjelke (LØGN-SEM) ⁶. men fordi disse teknikkene er ikke tilgjengelig på alle fasiliteter, foreslår vi array tomografi⁷ bruker SERIELL snitting og SEM. I array tomografi, seriell seksjoner kuttet ved hjelp av en ultramicrotome overføres til et glass dekkglass i stedet for en TEM rutenett og visualisere via lys mikroskopi og SEM⁸. For å forsterke signalet for Backscatter elektron (BSE), benyttet vi en Osmium-EM fargeprotokoll som sysselsetter tetroxide (OsO₄)-faste celler med osmiophilic THIOCARBOHYDRAZIDE (TCH)⁹, slik at vi kan få bilder uten dobbel farging etter innebygging.

I tillegg mitokondrie markør SCO1 (cytokrom c oksidase montering protein 1)-ascorbate peroksidase 2 (APEX2)¹⁰ molekylær tag ble brukt til å visualisere MITOKONDRIER på EM nivå. APEX2 er ca. 28 kDa og er avledet fra Soyabønne ascorbate peroksidase¹¹. Den ble utviklet for å vise detaljert plassering av spesifikke proteiner på EM nivå på samme måte som grønne fluorescerende protein-Tagged protein brukes i lys mikroskopi. APEX2 konverterer 3, 3 ‘-diaminobenzidine (DAB) til et uløselig osmiophilic polymer på stedet av koden i nærvær av kofaktor hydrogen peroxide (H₂O₂). APEX2 kan brukes som et alternativ til tradisjonelle antistoff merking i EM, med et protein lokalisering gjennom dybden av hele cellen. Med andre ord, det APEX2-merket protein kan visualisere etter spesifikk osmication¹¹ uten immunogold merking og permeabilization etter ultra-kryosnitt. Pepperrot peroksidase (HRP) er også en følsom kode som katalyserer H₂O₂-avhengige polymerisering av DAB inn i en lokalisert UTFELLING, og gir dem kontrast etter behandling med OsO₄. Er-målet peptid sekvens HRP-KDEL (lys-ASP-Glu-leu)¹² ble brukt til å visualisere er i en hel celle. For å evaluere vår protokoll for å utnytte genetiske koder og en blokk farging med redusert Osmium og TCH (rOTO-metoden), ved hjelp av osmication effekt på samme tid, sammenlignet vi membranen kontrast med og uten bruk av hver genetisk kode i rOTO en Bloc farging. Selv om 3DEM med array-tomografi og DAB-farging med APEX og HRP har henholdsvis blitt benyttet til andre formål, er protokollen vår unik fordi vi har kombinert array-tomografi for 3DEM og DAB-farging for mitokondrier og ER-merking. Nærmere bestemt viste vi fem celler med og uten APEX-Tagged gener i samme avsnitt, som hjalp i å undersøke effekten av genetisk modifisering på celler.

Protocol

1. cellekultur med mønstret rutenett kultur parabol og celle transfeksjoner med SCO1-APEX2 og HRP-KDEL plasmider vektor Seed 1 x 105 HEK293T celler ved å plassere dem i 35-mm glass Grid-bunn kultur retter i en fuktet atmosfære som inneholder 5% co2 ved 37 ° c i Dulbecco ‘ s modifiserte Eagle ‘ s medium (DMEM) supplert med 10% fosterets storfe serum, 100 U/ml penicillin og 100 U/mL Streptomycin. Dagen etter seeding cellene, når de har vokst til 50%-60% confluency, innføre SC…

Representative Results

Figur 1 beskriver tidsplanen og arbeidsflyten for denne protokollen. Protokollen krever 7 dager; Men, avhengig av tid brukt på SEM Imaging, dette kan øke. For celle transfeksjoner, bør confluency av cellene styres slik at de ikke dekker bunnen av hele gitter platen (figur 1a). En høy celle tetthet kan hindre identifisering av cellen av interesse under lys mikroskop og EM observasjon. Vi brukte genetisk merkede plasmider som uttrykte APEX2 og HRP å velge effektivt transfekterte celle…

Discussion

Bestemme mobilnettet lokalisering av spesifikke proteiner på en nanometer oppløsning ved hjelp av EM er avgjørende for å forstå cellulære funksjoner av proteiner. Vanligvis er det to teknikker for å studere lokalisering av et mål protein via EM. Den ene er immunogold teknikk, som har vært brukt i EM siden 1960, og den andre er en teknikk som bruker nylig utviklede genetisk kodede koder¹⁶. Tradisjonelle immunogold teknikker har brukt antistoff-bøyd gull partikler eller Quantum prikker for…

Materials

Glutaraldehyde	EMS	16200	Use only in fume hood
Paraformaldehyde	EMS	19210	Use only in fume hood
Sodium cacodylate	EMS	12300
Osmium tetroxide 4 % aqueous solution	EMS	16320	Use only in fume hood
Epon 812	EMS	14120	EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 – 0.8 ml
Ultra-microtome Leica ARTOS 3D	Leica	ARTOS 3D
Uranyl acetate	EMS	22400	Hazardous chemical
Lead citrate	EMS	17900
35mm Gridded coverslip dish	Mattek	P35G-1.5-14-CGRD
Glow discharger	Pelco	easiGlow
Formvar carbon coated Copper Grid	Ted Pella	01805-F
Hydrochloric acid	SIGMA	258148
Fugene HD	Promega	E2311
Glycine	SIGMA	G8898
3,3′ -diaminobenzamidine (DAB)	SIGMA	D8001	Hazardous chemical
30% Hydrogen peroxide solution	Merck	107210
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	SIGMA	P3289
0.22 um syringe filter	Sartorius	16534
Thiocarbonyldihydrazide	SIGMA	223220	Use only in fume hood
Potassium hydroxide	Fluka	10193426
L-aspartic acid	SIGMA	A9256
Ethanol	Merck	100983
Transmission electron microscopy	FEI	Tecnai G2
Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips	SPI	06489-AB	fragil glass
Isopropanol	Fisher Bioreagents	BP2618-1
Diamond knife	Leica	AT-4
Inveted light microscopy	Nikon	ECLipse TS100
Scanning electron microscopy	Zeiss	Auriga