Summary
אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את התפלגות המיטוסקופיה ורשתית העין בתאים שלמים לאחר שינוי גנטי באמצעות מיקרוסקופ האור והנפח האלקטרונים כולל ascorbate peroxidase 2 ו לחזרת peroxidase צביעת, שינוי סדרתי של תאים עם ובלי גן היעד באותו מקטע, והדמיה טורית דרך אלקטרון מיקרוסקופ.
Abstract
מארגני הסלולר, כגון רשתית המיטובית והאנדופלמיק (ER), יוצרים רשת לביצוע מגוון פונקציות. מבנים אלה מעוקל במיוחד מקופלים לצורות שונות כדי ליצור רשת דינמית בהתאם לתנאים הסלולריים. הדמיה של רשת זו בין המיטוגרם ו-ER כבר ניסה להשתמש ברזולוציה סופר פלואורסצנטית הדמיה ומיקרוסקופ אור; עם זאת, הרזולוציה המוגבלת אינה מספיקה להתבונן בקרומים שבין המיטו, ו-ER בפרוטרוט. מיקרוסקופ אלקטרוני שידור מספק ניגודיות ממברנה טובה רזולוציה בקנה מידה ננו להתבוננות של אורגלים סלולריים; עם זאת, היא צורכת זמן רב במיוחד כאשר מעריכים את מבנה תלת-מימדי (3D) של אורגלים מעוקלים במיוחד. לכן, הבחנו במבנה של המיטוסקופיה ו-ER באמצעות מיקרוסקופ האור אלקטרון (קלם) וטכניקות המיקרוסקופיה אלקטרונים באמצעות ascorbate peroxidase 2 משופר ומחזרת peroxidase צביעת. שיטה מכתימה בלוקים, מיקרוסקופ סדרתי דק (טומוגרפיה ממוחשבת), והמיקרוסקופיה אלקטרונית של אמצעי האחסון הוחלו כדי להתבונן במבנה התלת-ממדי. בפרוטוקול זה, אנו מציעים שילוב של המיקרוסקופיה אלקטרון תלת-ממד כדי לבצע מחקרים מבניים מפורטים של המיטולוגיה ו-ER.
Introduction
הרשת המיטו, והאנדופלזמית (ER) הן ממברנות סלולאריים מאוגדות. החיבור שלהם הכרחי עבור תפקידם, וחלבונים הקשורים לרשת שלהם תוארו1. המרחק בין המיטוגרם ו-ER דווח כ 100 ננומטר באמצעות מיקרוסקופ אור2; עם זאת, מיקרוסקופ סופר ברזולוציה האחרונות3 ו מיקרוסקופ אלקטרוני (EM)4 מחקרים חשפו אותו להיות קטן במידה ניכרת, על כ 10-25 ננומטר. הרזולוציה שהושגה במיקרוסקופיה ברזולוציה סופר נמוכה מ-EM, ותיוג ספציפי הוא הכרחי. EM היא טכניקה מתאימה כדי להשיג ניגודיות ברזולוציה גבוהה מספיק עבור מחקרים מבניים של הקשרים בין מיטוכונמיטוa ו-ER. עם זאת, חיסרון הוא המידע המוגבל של ציר z מכיוון שהסעיפים הדקים חייבים להיות כ-60 ננומטר או דק יותר עבור מיקרוסקופ אלקטרוני שידור קונבנציונאלי (TEM). עבור הדמיה מספקת של ציר EM z, מיקרוסקופ אלקטרוני תלת מימדי (3DEM) ניתן להשתמש5. עם זאת, זה כולל הכנת מאות חלקים סידוריים דקים של תאים שלמים, וזה עבודה מסובכת מאוד שרק כמה טכנולוגים מיומנים שולט. קטעים דקים אלה נאספים על הסרט formvar שברירי מצופה ברשתות TEM אחד-חור. אם הסרט נשבר על בחורה אחת, הדמיה טורית ושחזור נפח אינו אפשרי. בלוק סדרתי הסורק מיקרוסקופ אלקטרונים (SBEM) היא טכניקה פופולרית עבור 3DEM המשתמשת הרסני בלוקים בתוך המיקרוסקופ אלקטרון מיקרוסקופ (SEM) תא ואקום עם סכין יהלום או (דיכ-SBEM) או קרן יון ממוקדת (פרפור-SEM) 6. עם זאת, כיוון שטכניקות אלה אינן זמינות בכל המתקנים, אנו ממליצים על מערך טומוגרפיה7 באמצעות הגנות סדרתיות ו-SEM. In מערך טומוגרפיה, מקטעים סידוריים לגזור באמצעות ultramicrotome מועברים שמיכות זכוכית במקום רשת TEM ודמיינו באמצעות מיקרוסקופ אור SEM8. כדי לשפר את האות עבור הדמיה לאחור (bse) להדמיה, אנו מנוצלים באמצעות שימוש בפרוטוקול של כתמי EM באמצעות השימוש אוסמיום tetroxide (OsO4)-תאים קבועים עם osmi, thiolic הידרזידה (TCH)9, המאפשר לנו להשיג תמונות ללא כתמים כפולים שלאחר ההטבעה.
בנוסף, סמן מיטוכונדריאלי SCO1 (ציטוכרום c אוקסידאז הרכבה חלבון 1) – ascorbate peroxidase 2 (APEX2)10 תג מולקולרי שימש להמחיש המיטו, ברמת EM. APEX2 הוא כ 28 kDa ונגזר מ סויה ascorbate peroxidase11. זה פותחה כדי להראות את המיקום המפורט של חלבונים ספציפיים ברמה EM באותו אופן שבו חלבון פלורסנט ירוק מתויג חלבונים משמש במיקרוסקופ אור. APEX2 ממירה 3, 3 '-diaminobenzidine (בתוספת) לתוך פולימר מסיסים אוסמיפילית באתר של התג בנוכחות מימן הקופמי חמצן (H2O2). APEX2 יכול לשמש כחלופה לתיוג נוגדנים מסורתיים EM, עם לוקליזציה חלבון לאורך כל העומק של התא כולו. במילים אחרות, חלבון APEX2 מתויג יכול להיות מדמיינו על ידי ספציפי osmication11 ללא התוויות חיסוני והחדירות לאחר ההקפאה האולטרה. חזרת peroxidase (HRP) הוא גם תג רגיש אשר מזרז את ה-H2O התלויים החומר של התוספת לתוך מהפך מקומי, מתן ניגודיות EM לאחר הטיפול עם OsO4. רצף פפטיד היעד של המטרה HRP-KDEL (ליס-asp-לגלו-leu)12 הוחל על הדמיה של ER בתוך תא שלם. כדי להעריך את הפרוטוקול שלנו של ניצול התגים הגנטיים ואת הגוש בלוקים עם אוסמיום מופחת ו TCH (שיטת roto), באמצעות אפקט osmication באותו זמן, השוונו את הניגודיות הממברנה עם וללא שימוש של כל תג גנטי ב-roto בלוק בלוקים. למרות 3DEM עם טומוגרפיה מערך ו מכתים את השילוב עם איפקס ו HRP יש, בהתאמה, היה מנוצל למטרות אחרות, הפרוטוקול שלנו הוא ייחודי כי יש לנו מערך טומוגרפיה משולבת עבור 3DEM ו-מכתים את השילוב של המיטו, ותיוג ER. באופן ספציפי, הראנו חמישה תאים עם ובלי הגנים מתויגים איפקס באותו סעיף, אשר סייעה בחקירת ההשפעה של השינוי הגנטי על תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבות התא עם מיכל התרבות בדוגמת הרשת ומעבר תאים עם SCO1-APEX2 ו-HRP-KDEL וקטור.
- Seed 1 x 105 HEK293T תאים על-ידי הצבת אותם לתוך 35-mm זכוכית מנות התחתית התרבות באווירה מחולל לחות המכיל 5% CO2 ב 37 ° צ' ב בינונית שונה של הנשר של דולבCO (dmem) שיושלם עם 10% סרום שור עוברי, 100 U/mL פניצילין, ו 100 U/mL סטרפטומיצין.
- יום לאחר זריעת התאים, כאשר הם גדלו ל 50%-60% שליטה, להציג את SCO1-APEX210 ו hrp-kdel12 פלאמיד לתאים באמצעות מגיב החצייה על פי הוראות היצרן (SCO1-APEX2 cdna 0.5 μg + HRP-KDEL-DNA 0.5 μg לכל 3 מגיב μrfl.
2. מיקרוסקופ אור של תאים הגדלים על מנות תרבות בדוגמת וצביעת לAPEX2 ו HRP
- ב 16-24 h לאחר ההעברה, להסיר את כל התקשורת התרבותית ומיד להוסיף 250 μL של חם (30-37 ° c) פתרון קיבעון (שולחן 1) על ידי ליטוף עדין. להסיר מיד את הפתרון קיבעון ולהחליף אותו עם 1.5 mL של פתרון קיבעון טרי. דגירה על קרח עבור 60 דקות, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עבור 10 דקות כל אחד ב 1 מ ל של קרח קר 0.1 M נתרן קאבאיחור מאגר (שולחן 1).
התראה: אדי אלדהיד רעילים מאוד. בצע את כל העבודה תחת כיסוי מאוורר. - הוסף 1 מ ל של קר (0-4 ° c) 20 מ"מ תמיסת גליסין ו-דגירה עבור 10 דקות על הקרח ואחריו שלוש שוטף של 5 דקות כל אחד מ-mL של קר 0.1 M נתרן קאבישופות מאגר.
- הכנת פתרון מרענן של 1 x (3.33 mL של 0.3 M הפתרון השני של הקהשני + 10 μL של 30% H2O2 + 5.67 mL של מים קרים + 1 מ"ל 10x בתוך הפתרון).
- הוסף 500 μL של הפתרון הטרי בגודל 1x המוכן (שלב 2.3) ו-דגירה על הקרח במשך כ 5-45 דקות עד כתם חום בהיר גלוי תחת מיקרוסקופ אור הפוכה (איור 1X).
- להסיר בעדינות את הפתרון לטפוח ולשטוף שלוש פעמים עם 1 מ ל של קר 0.1 M נתרן קא, מאגר בזמן האחרון עבור 10 דקות כל אחד.
- השתמש במיקרוסקופ הפוך עם ניגודיות פאזה (או מיקרוסקופ אור בהיר) כדי להמחיש את הצביעת הסיביות בהגדלה של 100x או יותר. השתמש בעט סמן כדי לסמן את החלק התחתון של הזכוכית שבה אזור הריבית (ROI) ממוקם (איור 1B, C).
3. הכנה לדוגמא לבלוק EM
- ביצוע תרבות התאים וצביעת לטיפה כמתואר בשלבים 2.1-2.6.
- לאחר לתקן את הדגימות עם 1 mL של 2% מופחת OsO4 עבור 1 h ב 4 ° c.
התראה: יוסו4 האדים הם רעילים מאוד. בצע את כל העבודה תחת כיסוי מאוורר. - הכינו פתרון TCH חדש (טבלה 1) במהלך שלב 3.2 ולעבור דרך מסנן 0.22-μm.
התראה: אדי TCH רעילים מאוד. בצע את כל העבודה תחת כיסוי מאוורר. - הסר את הקבע ושטוף שלוש פעמים עם 1 מ ל של מים מזוקקים עבור 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר (RT).
- מניחים את התאים ב 1 מ ל של פתרון TCH בעבר מוכן מסונן עבור 20 דקות ב RT.
- לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1 מ ל של מים מזוקקים עבור 5 דקות כל אחד ב RT.
- לחשוף את התאים פעם שנייה ל 1 מ ל 2% אוסמיום tetroxide במים מזוקקים עבור 30 דקות ב RT.
- הסר את הקבע ושטוף שלוש פעמים עם 1 מ ל של מים מזוקקים עבור 5 דקות כל אחד ב-RT. הוסף 1 ml של 1% uranyl אצטט (ימית), ולעזוב את הלילה ב 4 ° c בחושך.
- לשטוף את התאים שלוש פעמים 1 מ ל של מים מזוקקים עבור 5 דקות כל אחד ב RT.
- הפתרון המוביל של וולטון לפני החום (שולחן 1) בתנור ב 60 ° c עבור 30 דקות.
- הכתם את התאים עם הפתרון המוביל של וולטון על ידי הוספת 1 מ ל של הפתרון טרום מחומם להוביל העופרת, ולאחר מכן מניחים בתנור עבור 30 דקות ב 60 ° c.
- לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1 מ ל של מים מזוקקים עבור 5 דקות כל אחד ב RT.
- מודטה בסדרה מדורגת של 2-mL האתנול האקאביטים (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) עבור 20 דקות כל אחד ב-RT.
- Decant האתנול ואת הדגירה עבור 30 דקות ב 1 מ ל של 3:1 אתנול: צמיגות נמוכה הטבעה תערובת בינונית ב RT.
- הסר את המדיום ולהוסיף 1 מ ל של 1:1 אתנול: צמיגות נמוכה הטבעה תערובת בינונית. דגירה עבור 30 דקות ב RT.
- הסר את המדיום ולהוסיף 1 מ ל של 1:3 אתנול: צמיגות נמוכה הטבעה תערובת בינונית. דגירה עבור 30 דקות ב RT.
- הסר את המדיום והוסף 1 mL של 100% מדיום הטבעה בצמיגות נמוכה ו-דגירה לילה.
- להטביע את המדגם ב 100% הטבעה בצמיגות נמוכה תערובת והדגירה עבור 24 h ב 60 ° c.
- הכן 90-ננומטר מקטעים עבים באמצעות בדיקת אולטרה-מיקרוטומה.
- צפו ברשת תחת TEM ב 200 kV.
4. סדרתי והרכבה על indium-בדיל-תחמוצת מצופה שמיכות עבור הדמיה SEM
-
הכנת מצע
- נקיון indium-בדיל-תחמוצת (איטו)-מצופה זכוכית שמיכות (22 מ"מ x 22 מ"מ) על ידי עצבנות עדינה ב איזופנול עבור 30-60 s.
- להסיר את הכיסויים, לנקז את עודף איזופנול, ולהשאיר בסביבה ללא אבק עד יבש.
- פנקו את שמיכות זכוכית מצופה איטו על ידי הפרשות זוהר באמצעות מתאם פלזמה עבור 1 דקות.
הערה: הפעלת פלזמה מהווה מאפיין הידרופילי על פני המצע. זה יוצר סרט דק מאוד של מים על מצע כדי למנוע את היווצרות קמט בסעיפים כאשר המקטע מחובר המצע. - הכנס את כיסוי הזכוכית מצופה איטו לתוך מחזיק המצע, ומקום לתוך הסירה הסכין.
-
חיתוך של בלוק המדגם והחסימה הטורית
- הכנס את בלוק המדגם לתוך מחזיק המדגם של האולטרה-מיקרוטומה והגדר לבלוק הגזם.
- השתמש להב גילוח כדי לקצץ את כל שרף עודף סביב מיקום היעד (מזוהה בשלב 2.6, איור 1D-G). צורת פני הבלוק צריכה להיות טרפז או מלבני. הקצה המוביל והקצה הנגרר חייבים להיות מקבילים באופן מוחלט (איור 1H, I).
- הכנס את מחזיק המדגם על זרועו של האולטרה מיקרוטומה ומניחים את סכין היהלום במחזיק הסכין. הכנס את שמיכות הזכוכית של ה-ITO לתוך מוביל הכלים והצמד את המנשא לידית (איור 1J). הגדר את מוביל הסרט לתוך סירת הסכין ולמלא את סירת הסכין עם מים מזוקקים מסוננים (איור 1K).
- כוונן את תנוחת המנשא עם שקופית הסכין על ידי דחיפת בזהירות של ידית המחזיק כדי לקבוע את הקצה של הזכוכית האיטו קרוב לסכין (איור 1L).
- לאחר גזירת הקטע, עצרו את התהליך הרציף, ופתחו באיטיות את הבורג ההידוק של הצינור וסוחטים את סירת המים (קצב הזרימה של טיפת מים אחת לשנייה).
- לאחר השלמת תהליך איסוף הכלים, הסר את המצע עם ידית האחיזה של המכשיר וייבש את רצועת הכלים (איור 1M).
5. הדמיה של ה-SEM והיישור של מחסנית תמונת ה-SEM
- הר את שמיכות מצופה איטו על רכיבי אלומיניום עם נייר דבק דביק. חותם את משטח הזכוכית ואת פני השטח בשארית עם נייר דבק דביק, ואז מעיל עם שכבת פחמן עבה 10 ננומטר (איור 1N).
- שים לב שמיכות מצופה איטו ב פליטת שדה SEM במתח האצה נמוך של 5 kV ו מרחק עבודה מתאים לאוסף יעיל של BSEs.
- יבא את התמונות הטוריות לתוכנת Image J (פיג'י)13 באמצעות האפשרות ' מחסנית וירטואלית '. פתח מקטע חדש14, ויבא את מחסנית התמונה לתוך trakem. לחצו על לחצן העכבר הימני ובחרו בתפריט ' יישור '.
- לאחר מכן בחרו בטווח התמונה (מהתמונה הראשונה לתמונה האחרונה). סיימו את היישור האוטומטי, שמרו את ערכת הנתונים המיושרת ובחרו ' ייצוא ' להידור תמונה שטוחה מטווח התמונה שנבחר (מהתמונה הראשונה לתמונה האחרונה). לבסוף, שמרו את נתוני התמונה השטוחים בתבנית AVI בתפריט הראשי של Image J.
הערה: סרט משלים 1 הסרט המשלים 2 להראות את מחסנית התמונה SEM ומחסנית תמונה חתוכה, בהתאמה.
6. פילוח של המיטומטר ו-ER מתמונות סדרתיות
- הפעל את 3dmod ב-IMOD15 תוכנה וקבצי תמונה פתוחים.
- בחלון ZaP, צייר את המתאר של המיטו, ו-ER באמצעות לחצן העכבר האמצעי.
- כדי להמחיש את אמצעי האחסון המקוקף, פתח את חלון תצוגת הדגם (סרט משלים 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מתאר את לוח הזמנים וזרימת העבודה עבור פרוטוקול זה. הפרוטוקול דורש 7 ימים; עם זאת, בהתאם לזמן שהושקע על הדמיה SEM, זה עשוי להגדיל. עבור העברה של תא, השטף של התאים צריך להיות נשלט כדי לא לכסות את החלק התחתון של לוח הרשת כולו (איור 1A). צפיפות תא גבוהה עלולה למנוע זיהוי של תא הריבית במיקרוסקופ אור והתבוננות ב-EM. השתמשנו גנטית מתויג פלמידים כי הביע APEX2 ו HRP לבחור ביעילות בתאים מזוהמים בין תאים תרבותיים רבים בצלחת התרבות. אנו מתורבתים HEK293T תאים ואישר את הביטוי של SCO1 מקושרים APEX2 (החלל הבין מיטוכונדריאלי [IMS]) ו-HRP מצועם KDEL (ER) בתאים משותפים. תחת מיקרוסקופ קל, התאים הAPEX2-מזוהמים הוכלו בצבע חום, ואילו תאים ללא מעבר נשארו בלתי מוכתמים (איור 1A ואיור 2). כך ניתן לזהות את תאי היעד של המקור, ששימשו לצורך מיקרוסקופ מהיר-אלקטרונים (קלם), תוך שימוש בצביעת מבנה באוכלוסיית תאים תרבותית (איור 3D-F ואיור 4b). מומלץ לסמן את תחתית הזכוכית (איור 1B, C) כדי להקל על זיהוי המיקום של תא היעד במהלך שלב ההטבעה השטוח (איור 1B, F). כאשר התאים HEK293T טופלו עם "כפול אוסמיום" מכתים פרוטוקול (rOTO), תאים שלמים היו צבע כהה (איור 1D). לאחר הסרת שמיכות החברה מתוך צלחת התרבות, זיהינו את מיקום היעד על משטח הבלוק תחת מיקרוסקופ סטריאו (איור 1G). קיצלנו את התאים בתוך ההחזר בצורת טרפז, והקצוות המובילים והנגררים נעשו במקביל (איור 1H, I). כדי ליישם המיטו, שיקום רשת ER, השתמשנו בסכין יהלום גדול עם סירת מים גדולה כדי בסעיף סדרתי SCO1-APEX2 ו HRP-KDEL-המבטא HEK293T תאים (איור 1J-L). סדרתי 90-ננומטר מקטעים ברצועת הכלים העבים צורפו בהצלחה את שמיכות זכוכית מצופה איטו (איור 1m), ועל פני השטח היה מצופה פחמן עבה 10 ננומטר להתבוננות דרך SEM (איור 1m).
SCO1-APEX2 ו HRP-KDEL חלבונים לייצר אותות אלקטרוניים צפופים מאוד נגזר המרה מאוד כי הם לזיהוי ב TEM (איור 3) ו-SEM (איור 4). הכתם האפל שנוצר על ידי SCO1-APEX2 נצפתה באופן בלעדי ב-IMS ולא במרחב מטריקס של המיטורציה (איור 3D). תאים שכונתיות (התא השמאלי באיור 3D, E) עם שני SCO1-APEX2 ו hrp-kdel מפלפידים הביעו אות אלקטרון צפוף מאוד ב-IMS מיטוכונדריאלי ו-ER; עם זאת, לא הבחנו ER מכתים בתאים שהיו מנוכר רק עם SCO1-APEX2 (התא הימני באיור 3D, F). בתמונות סדרתיות המשתמשות ב-SEM, תחילה יצרנו סקירה של תמונת המערך כולה באמצעות גלאי ה-BSE על פני שטח גדול (איור 4A). שנית, ההחזר הראשוני הוצב בסעיף הראשון והופץ לכל הסעיפים האחרים (איור 4B). לבסוף, דמיינו את התשואה המכילה חמישה תאים היעד עם פיקסלים בתמונה 5 ננומטר (איור 4C). תמונות מוגדלת התגלו מבנים תת תאיים מפורטים (איור 4D) כגון מערכת golgi, המיטותרפיה, גרעינים, ו-ER. התמונות הסדרתיות הראו בבירור כי אנשי הקשר ER-מיטוa הופיעו על z-מטוסים שונים (סרט משלים 2 ו סרט משלים 3).
איור 1 : שאלה של תהליך עבודה הכנה בשפע עבור SEM ו-TEM. (א) מאכל תרבותי המכיל שמיכות מוקלטות ביחד עם תאים ומוכתם ב-"קמצוץ". (ב,ג) לאחר הכתם, עט סמן שימש כדי לסמן את החלק התחתון של הזכוכית שבה תאי היעד היו ממוקמים. (ד) לאחר oso4 כתמים, התאים הופכים צבע כהה. (E, F) שרשרת פולימראז (PCR) צינורות (או כל סוג של קפסולות הטבעה) שימשו בקלות ליצור בלוק EM שהכיל את המיקומים המסומנים. (E) למעלה. (ו) השקפה תחתונה. (G) תמונת מיקרוסקופ סטריאו בעלת הגדלה נמוכה של פני השטח של בלוק EM. (ח) ההחזר הוא באמצע המשטח השטוח. (I) תמונה מיקרוסקופית סטריאו בעלת הגדלה גבוהה יותר של ההחזר המלבני. (J) הוספת שמיכות זכוכית מצופות (י) (כוכבית לבנה) מוכנסים לתוך מוביל הכלים (חץ כחול), והמוביל מהודק על-ידי הפעלת הידית בכיוון השעון. (K, L) ידית של המחזיק הוא דחף בזהירות, והמוביל מותאם למקם את הקצה של שמיכות זכוכית מצופה איטו קרוב לסכין על ידי הזזה. (ז) הסרטים מחוברים לכיסויים של כיסוי הזכוכית המטוצופים. (N) שמיכות הזכוכית הצופות מצורפות לרכיבי ה-SEM, והזכוכית השיורית אטומה בנייר דבק דביק ומצופה בשכבת חוט פחמן באורך 10 ננומטר. כוכביות לבנות מציינות את שמיכות הזכוכית המצופה ב-ITO, וכוכביות שחורות מציינות את קלטת הפחמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: היפוך הפאזה ההפוכה מיקרוסקופית התמונה של תאים HEK293T מוכתמים באמצעות "קמצוץ". (א) צביעת תאים בלבד (ללא oso4 כתמים). חיצים לבנים מציינים את התאים הבלתי מוכתמים, וחיצים שחורים מציינים תאים מוכתמים בקלות. (ב) הגדלה יותר של תמונה של ה-ROI. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : הדמיה TEM של תאים HEK293T מציג את ה-IMS מיטוכונדריאלי ייעודי (SCO1-APEX2) ו-ER (HRP-KDEL). (א-ג) תאים HEK293T מאוד מראה את קרום כפול של המיטומטר (M) ו רשתית פלזמית הרשתית (ER). (D-F) APEX2 ו-HRP מאיצים את הפילמור בתוך מפרץ מקומי, שהוא מוכתם לאחר מכן עם האלקטרון-צפוף OsO4. ניגודיות אפלה נראית בבירור ב-IMS מיטוכונדריאלי (ראש חץ שחור) ו-ER (חץ שחור); עם זאת, תאים שלא היו מזוהמים עם HRP – KDEL התערוכה מוכתם ER (חץ לבן). סרגלי קנה מידה: 1 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדמיה טורית ה-SEM של תאים HEK293T המציגות את ה-IMS מיטוכונדריאלי ייעודי (SCO1-APEX2) ו-ER (HRP-KDEL). (א) מבט כולל על רצועות הסרט הטוריות שנצפו באמצעות גלאי ה-bse. (ב) מתאם של תמונה בעלת הגדלה נמוכה (הזחה) עם תמונת bse בעלת הגדלה גבוהה (תיבת קווים מנוקדים לבנה מציינת את ההחזר של תאים מוכתמים בקלות). (C) הגדלה גבוהה של תאי היעד של ROI עם פיקסלים של תמונה בגודל 5 ננומטר. (D, E) ניגודיות אפלה ברורה ב-IMS מיטוכונדריאלי ו-ER, אך לא במנגנון Golgi. (F-I) הקשר ER-מיטו, (חץ לבן) מתרחשים על z מטוסי שונים. נ', גרעין; M, המיטומטר; . אה, עין פלפלזמית . ג'י, מערכת גולג'י אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: מתכוני פתרונות.
משלים סרט 1: מחסנית תמונה SEM. פיג'י13 עם trakem14 התוכנה שימש כדי ליישר 91 תמונות. ערכת הנתונים המיושרת המקורית היא 11 GB. כדי להקטין את גודל המחסנית, נעשה שימוש בערכת התמונה שגודלה השתנה ונחתכה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
סרט משלים 2: מחסנית תמונה חתוכה. כדי להמחיש את המיטו, ER ואתרי הקשר שלהם בפירוט, תמונות נחתכו מתוך ערכת נתונים מקורית (5 ננומטר/פיקסל). סרגלי קנה מידה: 1 μm. לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
משלים סרט 3:3D שחזור של מיטוכונמיטואה ו-ER. עבור הדמיה תלת-ממדית, מתאר המיטו, ו-ER היה מקוטע ודמיינו באמצעות IMOD15 תוכנה. המיטו, היו דמיינו מבנים הכרישים ארוך (אדום), ורשתות ER (ירוק) הראו את המבנה המורכב שלהם. צהוב ייצג שטח גדול שטח של אתר קשר בין המיטו, ו-ER במטוסי z שונים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קביעת הלוקליזציה התאית של חלבונים ספציפיים ברזולוציית ננומטר באמצעות EM היא חיונית כדי להבין את הפונקציות הסלולר של חלבונים. בדרך כלל, ישנן שתי טכניקות ללמוד לוקליזציה של חלבון היעד באמצעות EM. אחת היא טכניקת החיסוני זהב, אשר נעשה שימוש EM מאז 1960, והשני הוא טכניקה באמצעות לאחרונה פיתח תגים מקודד גנטית16. שיטות האנטי מסורתיות שהיו מועסקים נוגדנים-חלקיקי זהב או נקודות קוונטיות כדי להראות את המיקום של החלבון המסומן. עם זאת, בשל הדרישה של נוגדנים באיכות גבוהה ואת יעילות החדירה של נוגדנים מושפע שרף וfixative, טכניקה זו היא מוגבלת באופן משמעותי17. באופן ספציפי, משום שתיוג מזהב חיסוני מוגבל ברובו למשטח של מקטע באולטראדק ללא כתמי מתכת בלוקים וקיבוע של אוסמיום חזק, טכניקה זו אינה ישימה ישירות על 3DEM המודרנית18. כדי להשתמש בשיטות 3DEM האחרונות, כולל SBEM ו טומוגרפיה מערך, עם תוויות חלבונים, אנו משתמשים תגי EM מקודד גנטית בפרוטוקול זה. תגים מקודדים גנטית אינם דורשים חדירות, מבחינה טכנית דורשים הרבה הקפאה, וכתמים חיסוני של סעיפים בודדים משום שהם לוקליזציה לאתר העניין לפני קיבעון.
ההליכים עבור הכנה לדוגמה ב-3DEM בדרך כלל כוללים שילוב של קיבעון כימי נפוץ מתכת כבדה שיטות מכתים כי התאים מורכבים בעיקר של C, H, O, ו-N, המחייב כתמים עם מתכות כבדות לרכוש ניגודיות תחת EM9 . לכן, אנו המועסקים הופחת קיבעון אוסמיום וכתמי מתכת כדי לשפר את הניגודיות ואת מוליכות עבור הדמיה טורית. ההליך כדי להכתים דגימות לפני הפחתת, המכונה כתמי בלוקים, דווח כצעד חיוני עבור שיטות 3DEM כגון SBEM ו פרפור-SEM19. אנו אישר כי התאים בלוקים מוכתם בפרוטוקול שלנו הפגינו ברור SCO1-APEX2 ו HRP-KDEL EM ניגודיות בלעדית ב-IMS מיטוכונדריאלי ו-ER, בהתאמה, ב TEM (איור 3). יתר על כן, תמונות ה-SEM מתוך 90-ננומטר סעיפים סדרתיים חשפו ניגוד ברור בשתי האורגלים (איור 4). בעיקר, הניגודיות המשופרת של כתמים בגוש העין היתה להבדיל בבירור מהאות ' הקשר ', והניגודיות והמוליכות הביאו לתמונות סדרתיות באיכות טובה (איור 4). בנוסף, ניגודיות גבוהה זו מסייעת להנחיה של משימות עוקבות כגון יישור ופילוח עם תוכנת תמונה תלת-ממדית (3D).
בשנים האחרונות, טכניקות מיקרוסקופ בנפח אלקטרוני (דיכ-SBEM, פרפור-SEM, ו טומוגרפיה ממוחשבת) ענו על שאלות ביולוגיות שדרשו התבוננות בשדה גדול של נוף ובתצוגת תלת מימד. דיכ-SBEM ו פרפור-SEM לא מערבת את הטיפול הפיזי של סעיפים, אז זמן רב עבור יישור של תמונות ניתן להפחית. עם זאת, יש להשמיד את המדגם כדי להשיג תמונות טוריות, ושדה התצוגה קטן יותר מזה של טומוגרפיה של מערך. הדמיה של SEM טורי באמצעות מערך טומוגרפיה מועסק יותר ויותר כחלופה לעדכון הסדרתי של TEM, והיתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הצורה הלא-הרסנית שלה והשדה הגדול של התצוגה. שלא כמו שיטות 3DEM אחרות כגון דיכ-SBEM ו פרפור-SEM, מקטעים ניתן לאחסן על שמיכות, שמיכות ITO-מצופה, וופל סיליקון, או קלטת והוא יכול להיות שוב ושוב התמונה7.
APEX2 הוא קל לשימוש והוא יכול לתת מגוון רחב של צפיפות מכתים ללא ציוד מיוחד, בניגוד מיני מחולל חמצן הגנרטור20 או חלבון פלורסנט21 טכניקות, הפקת משקעים משקע באמצעות פוטוחמצון. היישום המשתנה שלה נבדק במספר אורגלים סלולאריים כולל גרעין, קרום פלזמה, מטריצה המיטואיטין, cristae מיטוכונדריאלי, ER, טובולין, ו אקטין ב COS 7 ו HEK293T cell22. עם זאת, ישנן מספר מגבלות ומספר מחסומים לשימוש בתיוג מקודד גנטית במיקרוגרפים אלקטרונים. רמות הביטוי של הגנים האקסוגני צריך להיות נשלט כדי להשיג כתמים סבירים ברמת EM כי אם הביטוי של התג הגנטי הוא גבוה מדי, זה עלול לגרום שווא אותות חיוביים וperturb את מבנה האולטרה של תאים באמצעות קרע ממברנה ומצבור23. עוד בעיה אפשרית היא הקטנה, אשר דווחה לגרום לטשטוש ולהרס קרום22. כדי להבטיח את הביטוי המתאים של הגנים, תאים מוכתמים ביניהם הושוו עם תאים לא מוכתמים באמצעות מיקרוסקופ אור EM (איור 2 ואיור 3). בנוסף, את רמת הקיבעון צריך להיות מוסדר היטב כדי להבטיח כי oxidases אנדוגניים הם לא פעיל לחלוטין. כדי למנוע את כל החפצים מoxidases אנדודוגני במהלך העיבוד, תיקנו מונאולייר של תאים במקום באמצעות תאים מנותקים ומטרים24. זה עזר גם לזהות את תאי העניין כאשר בדקנו את האות באמצעות מיקרוסקופ אור. כך, התוצאות שלנו מצביעות על כך את הצביעת ואת הקיבעון של מונאולאיירס התא הם שימושיים ב-מכתים (איור 2). התמונות הסדרתיות עם מערך טומוגרפיה ודגם תלת-ממדי חשפו שאתרי הקשר ER-מיטוa מתרחשים במטוסי z שונים (סרט משלים 2 וסרט משלים 3). התמונה מייצרת הדמיה תלת-ממדית מלאה של מיטוכונדריאלי ורשתות ER בתאים שלמים (סרט משלים 1). הוא מציע 3D ניתוח נפח חיוני עבור השוואה כמותית של אנשי הקשר ER-מיטוa. כאשר לומדים את הרשתות המורכבות של האורגתי התאיים, זוהי טכניקה שימושית במיוחד.
לסיכום, פרוטוקול זה היה שילוב יעיל של שיטות ה-קלם ו-3DEM שאפשרו חקירה תא שלם ברמת EM. בעיקר, שני תגים שונים באותו הזמן ואותות בשתי מארגני שונים היו גלויים בתא שלם. בנוסף, ניתן להשוות בין תאים ותאים שאינם מסומנים בתווית באותו מקטע, בגלל מידה גדולה של EM. בפרוטוקול זה, הגוש מכתים ומאותת מתגים מקודדים מבחינה גנטית היו שימושיים לחקור את האינטראקציה בין קרומי אורגלים בתאים שלמים. זה יכול להיות יישום מתאים עבור EM בקנה מידה גדול כדי לחקור אינטראקציות סלולר אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי התוכנית מחקר בסיסי של KBRI באמצעות קוריאה מכון מחקר המוח ממומן על ידי משרד המדע והתקשוב (19-BR-01-08), וקרן המחקר הלאומי של קוריאה (NRF) גרנט ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT) (לא. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 ו-HRP-KDEL פלמידס המסופקים באדיבות היאן-וו רי (האוניברסיטה הלאומית של סאול). נתוני TEM נרכשו בבית מחקר המוח מתקנים ליבה ב KBRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | Use only in fume hood |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | Use only in fume hood |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 4 % aqueous solution | EMS | 16320 | Use only in fume hood |
| Epon 812 | EMS | 14120 | EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml |
| Ultra-microtome Leica ARTOS 3D | Leica | ARTOS 3D | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| 35mm Gridded coverslip dish | Mattek | P35G-1.5-14-CGRD | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| Formvar carbon coated Copper Grid | Ted Pella | 01805-F | |
| Hydrochloric acid | SIGMA | 258148 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | |
| Glycine | SIGMA | G8898 | |
| 3,3′ -diaminobenzamidine (DAB) | SIGMA | D8001 | Hazardous chemical |
| 30% Hydrogen peroxide solution | Merck | 107210 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | SIGMA | P3289 | |
| 0.22 um syringe filter | Sartorius | 16534 | |
| Thiocarbonyldihydrazide | SIGMA | 223220 | Use only in fume hood |
| Potassium hydroxide | Fluka | 10193426 | |
| L-aspartic acid | SIGMA | A9256 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Transmission electron microscopy | FEI | Tecnai G2 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips | SPI | 06489-AB | fragil glass |
| Isopropanol | Fisher Bioreagents | BP2618-1 | |
| Diamond knife | Leica | AT-4 | |
| Inveted light microscopy | Nikon | ECLipse TS100 | |
| Scanning electron microscopy | Zeiss | Auriga |
References
- Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
- Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians. International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).
- Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).
- Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
- Lee, S. Y., et al. APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest. Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons. Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Kijanka, M., et al. A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).
- Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX. Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).
- Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 7923 (2015).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).
- Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein. PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).
- Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).
