बीके-पॉलीओमावायरस गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र संचालित ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि वाया फ्लो साइटोमेट्री का मापन
Summary
इस पांडुलिपि में, एक प्रोटोकॉल एक द्विदिश रिपोर्टर प्लाज्मिड tdTomato और eGFP व्यक्त करने के साथ transfected HEK293T कोशिकाओं का उपयोग करके बीके-पॉलीओमावायरस ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि के FACS आधारित माप प्रदर्शन करने के लिए प्रस्तुत किया है। इस विधि को आगे मात्रात्मक वायरल प्रतिलेखन पर उपन्यास यौगिकों के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है.
Abstract
Polyomaviruses, बीके-पॉलीओमावायरस (BKPyV) की तरह, प्रतिरक्षा समझौता रोगियों में गंभीर रोगों का कारण बन सकता है। हालांकि, चूंकि अत्यधिक प्रभावी एंटीवायरल वर्तमान में उपलब्ध नहीं हैं, इसलिए संभावित एंटीवायरल एजेंटों के प्रभाव को मापने के तरीकों की आवश्यकता है। यहाँ, एक दोहरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर है कि BKPyV गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र (NCCR) जल्दी और देर प्रमोटर गतिविधि संचालित के विश्लेषण की अनुमति देता है tdTomato और eGFP के माध्यम से वायरल जीन अभिव्यक्ति पर संभावित एंटीवायरल दवाओं के प्रभाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए निर्माण किया गया था अभिव्यक्ति. इसके अलावा, बीकेपीवी-एनसीसीआर एम्प्लियन्स की क्लोनिंग करके, जो इस प्रोटोकॉल में प्रतिरक्षा-संपीड़ित गुर्दे के प्रतिरोपित रोगियों के रक्त व्युत्पन्न डीएनए से प्राप्त किए गए हैं, वायरल जीन अभिव्यक्ति पर एनसीसीआर-पुनर्व्यवस्थाओं के प्रभाव का निर्धारण किया जा सकता है। रोगी व्युत्पन्न amplicons की क्लोनिंग के बाद, HEK293T कोशिकाओं रिपोर्टर-प्लास्मिड के साथ transfected थे, और संभावित एंटीवायरल एजेंटों के साथ इलाज किया. बाद में, कोशिकाओं को माध्य फ्लोरोसेंट तीव्रता 72 एच पोस्ट ट्रांसफेक्शन को मापने के लिए FACS-विश्लेषण के अधीन किया गया। यह भी दवाओं है कि एक संभावित सेल चक्र बाधा प्रभाव है के विश्लेषण का परीक्षण करने के लिए, केवल transfected और इस तरह फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है. चूंकि इस परख बड़े टी Antigen व्यक्त कोशिकाओं में किया जाता है, जल्दी और देर से अभिव्यक्ति के प्रभाव को एक पारस्परिक रूप से स्वतंत्र तरीके से विश्लेषण किया जा सकता है.
Introduction
Polyomaviruses एक प्रोटोटाइप प्रजातियों के रूप में Siman वायरस 40 (SV40) के साथ छोटे डबल-स्लेंड डीएनए (dsDNA) वायरस के एक स्वतंत्र परिवार का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्राथमिक संक्रमण मुख्य रूप से बचपन के दौरान होता है, जो आमतौर पर रोग के लक्षणों के बिना आगे बढ़ता है और आमतौर पर प्रतिरक्षा सक्षम मेजबानों में गुप्त संक्रमण का कारण बनता है। बीके-पॉलीओमावायरस (BKPyV) मुख्य रूप से नेफ्रोपैथोलॉजिस्ट के कारण के बिना गुर्दे ट्यूबल कोशिकाओं में बनी रहती है, हालांकि, गुर्दे प्रत्यारोपण के बाद प्रतिरक्षा क्षमता की हानि के मामले में वायरस को पुनः सक्रिय कर सकते हैं और गंभीर नुकसान और बिगड़ा भ्रष्टाचार का कारण बन सकता है समारोह जब एक उच्च viremia तक पहुँचने (1 x 104 BKPyV डीएनए प्रतियां / गुर्दे प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के लगभग 10% में, बीके-पॉलीओमावायरस (BKPyV) के पुनः सक्रियण एक polyomavirus जुड़े नेफ्रोपैथी (PyVAN) मेंपरिणाम है, जो 80% गुर्दे allograft विफलताओं के एक उच्च जोखिम के साथ जुड़े 3,4 . चूंकि कोई अनुमोदित एंटीवायरल एजेंट उपलब्ध नहीं हैं, वर्तमान चिकित्सा इम्यूनोसुप्रेशन की कमी पर आधारित है। दिलचस्प बात यह है कि, MTOR अवरोधकों का एंटीवायरल प्रभाव होता है; इस प्रकार, इम्युनोसुप्रेसिव थेरेपी को एम टी आर-आधारित इम्यूनोसुप्रेशन में बदलने से बीकेपीवी विरेमिया5,6,7की प्रगति को रोकने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व हो सकता है। हालांकि, MTOR आधारित एंटीवायरल तंत्र वर्तमान में अभी भी अधूरा समझ में आ गया है. इस प्रकार, नैदानिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता में संभावित एंटीवायरल एजेंटों के प्रभाव को मापने के तरीकों की आवश्यकता है।
BKPyV के परिपत्र जीनोम लगभग 5 केबी एक गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र (NCCR) है कि प्रतिकृति और संयोग से एक द्विदिश प्रमोटर जल्दी और देर से चरण MRNA प्रतिलिपि की अभिव्यक्ति ड्राइविंग के एक मूल के रूप में कार्य करता है शरण के होते हैं. स्वतः होने वाली NCCR-पुनर्व्यवस्थापन, विलोपन, और duplications रोगजनक BKPyV8 में पाए जाते हैं और काफी PVANसेपीड़ित रोगियों में जमा5 ,9, आर्केटाइपिक (डब्ल्यूटी) की तुलना और पुन: व्यवस्थित (आरआर) एनसीसीआर-कार्यकलाप वायरल प्रतिकृति फिटनेस की विशेषता के लिए सहायक होते हैं।
जैसा कि चित्र 1में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है , यह प्रोटोकॉल बीकेपीवी एनसीसीआर ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को मापने के लिए सामान्य रूप से प्रयुक्त विधि का वर्णन करता है, जो दो फ्लोरोफोर्स tdTomato और eGFP के फ्लोरोसेंट को मापने के लिए एक रिपोर्टर प्लाज्मिड5से व्यक्त किया जाता है, 9,10,11. प्रक्रिया SV40 बड़े टी प्रतिजन (lTAg) की उपस्थिति में किया जाता है, जो जल्दी और देर से NCCR-सक्रियता पर संभावित एंटीवायरल एजेंटों के प्रभाव का विश्लेषण करने की अनुमति देता है अलग से5. यह परख आगे एनसीसीआर गतिविधि पर पुनर्व्यवस्था ओंकारने के प्रभाव और डब्ल्यूटी-एनसीसीआर5,9 के साथ तुलना का विश्लेषण करतीहै. रिपोर्टर प्लाज्मिड क्रमशः tdTomato और eGFP के लिए दोनों प्रतिलिपि के तुलनीय और कुशल प्रसंस्करण सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक fluorophore खुला पढ़ने फ्रेम के बहाव SV40 देर polyadenylation संकेत बंदरगाह. QRT-पीसीआर आधारित तरीकों की तुलना में5,12, इस FACS आधारित दृष्टिकोण संक्रमित सेल संस्कृति और कोई महंगा के लिए कोई जटिल निष्कर्षण प्रोटोकॉल के बाद से एक कम लागत और उच्च थ्रूपुट संगत विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है प्रतिरक्षा फ्लोरोसेंट धुंधला के लिए एंटीबॉडी की जरूरत है. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की एक परिभाषित राशि प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से विश्लेषण कर रहे हैं के बाद से, सेल चक्र बाधा एजेंटों का विश्लेषण भी एक मात्रात्मक तरीके से संभव है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख में, एक आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि प्रस्तुत किया है कि BKPyV गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र (NCCR) जल्दी और देर से प्रमोटर गतिविधि संचालित के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. एनसीसीआर गतिविधि को एक साथ माप?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए बारबरा Bleekmann धन्यवाद. इन अध्ययनों Duisburg-एस्सेन मेडिकल स्कूल के विश्वविद्यालय के IFORES कार्यक्रम और विश्वविद्यालय एलायंस Ruhr और Mercator अनुसंधान केंद्र Ruhr (MERCUR) के RIMUR कार्यक्रम द्वारा समर्थित थे. लेखक हेलेन Sertznig और लगातार समर्थन की डॉक्टरेट फैलोशिप के लिए जेरगेन-मंचोट-स्टिफटंग धन्यवाद. रोगी सामग्री के संग्रह और उपयोग विश्वविद्यालय Duisburg-Essen (14-6028-BO) के चिकित्सा संकाय की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है.
Materials
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
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