Summary
在本手稿中,提出了使用 HEK293T 细胞转染的基于 FACS 的 BK-多瘤病毒转录活性的测量方案,该细胞与表达 tdTomato 和 eGFP 的双向报告质粒转染。该方法进一步允许定量确定新化合物对病毒转录的影响。
Abstract
多瘤病毒,如BK-多马病毒(BKPyV),可引起免疫功能低下患者的严重疾病。然而,由于目前没有高效抗病毒药物,需要用测量潜在抗病毒药物影响的方法。在这里,一个双荧光报告器,允许分析BKPyV非编码控制区域(NCCR)驱动的早期和后期促进者活动,以量化潜在的抗病毒药物对病毒基因表达的影响,通过tdTomato和eGFP表达。此外,通过克隆BKPyV-NCCR增压,该议定书中从免疫功能低下的肾移植患者的血液衍生DNA中得到的,可以确定NCCR-重组对病毒基因表达的影响。在克隆患者衍生的氨基细胞后,HEK293T细胞与报告质粒转染,并用潜在的抗病毒剂进行治疗。随后,对细胞进行FACS分析,以测量转染后72小时的平均荧光强度。为了测试具有潜在细胞循环抑制作用的药物的分析,只使用转染的荧光细胞。由于这种测定是在大T抗原表达细胞中进行的,因此可以相互独立地分析早期和晚期表达的影响。
Introduction
聚瘤病毒代表一个独立的小双链DNA(dsDNA)病毒家族,以西米安病毒40(SV40)为原型物种。原发性感染主要发生在儿童期,通常无疾病症状,通常引起免疫宿主的潜在感染。BK-多瘤病毒(BKPyV)主要在肾小管细胞中持续存在,不会引起肾病,但是,在肾移植后免疫能力受损的情况下,病毒可以重新激活,并造成严重的损害和受损的移植物功能达到高病毒血症 (1 x 104 BKPyV DNA 拷贝/mL)1,2 。在大约10%的肾脏移植接受者中,BK-多瘤病毒(BKPyV)的重新激活导致多瘤病毒相关肾病(PyVAN),高达80%与肾异体移植失败的高风险相关3,4.由于没有经过批准的抗病毒药物,目前的治疗是基于减少免疫抑制。有趣的是,mTOR抑制剂似乎具有抗病毒作用;因此,将免疫抑制疗法切换到基于mTOR的免疫抑制可能是防止BKPyV病毒血症5、6、7进展的替代方法。然而,基于mTOR的抗病毒机制目前仍不完全了解。因此,需要测量潜在抗病毒药物在临床相关浓度中的影响的方法。
BKPyV的循环基因组包括大约5 kb,包含一个非编码控制区域(NCCR),作为复制的起源,并同时作为一个双向启动子,推动早期和晚期相mRNA转录的表达。由于自发发生的NCCR-重排、删除和复制在致病性BKPyV8中发现,并且明显累积在PVAN 5,9患者中,原型(wt)和重新排列 (rr) NCCR 活动有助于描述病毒复制性适应性。
如图1所概述,该协议描述了一种常用的方法,通过量化从报告质粒5表达的两种荧光团和eGFP的荧光来测量BKPyV NCCR转录活性。 9,10,11.该程序在SV40大T抗原(lTAg)的存在下进行,它允许分析潜在的抗病毒药物对NCCR活性的早期和晚期的影响5。该测定进一步分析了重组对NCCR活动的影响,并与wt-NCCRs5、9进行了比较。记者将SV40晚聚光信号下行到每个荧光光片开放读取帧的下游,以确保分别对tdTomato和eGFP的两种转录本进行可比和高效的处理。与基于qRT-PCR的方法5,12相比,这种基于FACS的方法代表了低成本和高吞吐量兼容的替代方法,因为没有复杂的提取协议,感染细胞培养,没有昂贵的需要用于免疫荧光染色的抗体。此外,由于通过流式细胞测定分析定义的荧光细胞量,因此也可以定量分析细胞周期抑制剂。
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Protocol
本议定书遵循杜伊斯堡-埃森大学医学院伦理委员会(14-6028-BO)批准的人类研究准则。
1. 采集血液或尿液样本,分离多瘤病毒DNA
- 在EDTA管中采集至少3 mL的血液,或在采集管中收集尿液。
- 将样品在2,500 x g下离心15分钟。如果需要,将等离子移液器放入新管中,将等离子样品储存在 4°C 下数天,或在 -20°C 冷冻,以延长存储时间。
- 将40μL蛋白酶K制备到1.5 mL微离心管中,并通过移液加入400μL的血浆。
- 通过加入400 μL的解液缓冲液,涡旋15秒,并在56°C孵育10分钟,使样品解毒。
- 按照制造商说明中所述,使用 DNA 血液提取试剂盒分离 DNA。简单地说,添加酒精,并将酸胶加载到含有DNA结合硅基膜的旋转柱上。洗几次柱子,产生纯DNA。
- 在30-50μL的TE缓冲液中释放产生的DNA。
2. 扩大非编码控制区域(NCCR)
- 在物理分隔的房间中执行以下步骤。使用隔离室制备试剂并将混合物分配到 PCR 管中。
- 使用引体对 A (表 1) 在总体积为 50 μL 时为预 PCR 准备主混合物,并使用步骤 1.6 中先前分离的 DNA。表2中打印了用于制备预和嵌套PCR主混合物的移液方案。
- 将 45 μL 的主混合物分配到 PCR 管中。
- 将5μL的分离DNA加入PCR管中。
注:使用主混合准备室以外的房间,以避免污染。 - 使用表 3所示的反应条件运行 PCR。在 35 个周期内重复变性、退火和延长。
- 对于嵌套放大,使用引基对 B 为 AgeI 和 SpeI 提供限制位点(表 1)。
- 使用预PCR的5μL,使用步骤2.2至2.5中所述的反应条件运行嵌套PCR。
- 将 PCR 产物的 10 μL 与 2 μL 的 6x 凝胶加载染料混合。在1.5%的甘蔗凝胶上加载10μL的混合物,并在60 mA下运行凝胶30分钟。
- 使用适当的紫外线记录系统可视化凝胶。
注: 放大素的大小预计在 300-500 bp 之间,具体取决于是否发生重新排列(删除、插入或重复)(图 2C)。 - 根据制造商的说明,使用 PCR 净化套件净化 PCR 放大器。在30 μL的洗脱缓冲液中洗脱PCR增脂剂。
- 使用引物对 B 发送桑格测序的放大器。
3. 将NCCR克隆成双荧光报告器
- 如表4所述,在37°C下用AgeI和SpeI消化纯化的安理拉放大器(步骤2.10)。
- 重复步骤2.10并净化消化的放大器。
- 同时,如表5所述,在37°C下,用AgeI和SpeI消化质粒主干(1.5μg)2小时。此步骤只需执行一次。对于后续反应,将消化冻结在-20°C。
- 分析0.8%低熔胶胶上消化的质粒主干。
注:请勿在电流高于 40 mA 时运行凝胶。垫段区域的预期插入物最初来自质粒 pEX-K4 2-LTR CD313为 128 bp(图 2C)。 - 使用长波紫外线(320 nm)可视化 DNA 片段,并使用干净的手术刀切断骨干带。将低熔凝胶片段转移到新的1.5 mL微离心管中。避免长时间的紫外线照射,以防止DNA损伤。
注:由于使用低熔胶胶,因此没有必要在结扎前纯化DNA。 - 在 65°C 下加热含有低熔胶的以解决胶片 10 分钟,以熔化凝胶片,并通过温和的涡旋每 2 分钟混合一次。熔化的凝胶可直接用于结扎。
- 使用表6所示的方案,在16°C的夜间使用T4DNA联成酶对骨干和消化的放大素进行激光处理。
- 使用热休克法对大肠杆菌进行转化,在LB-amp板上盘细菌,并在37°C下在夜间培养。
- 第二天,选择三个阳性克隆,并准备一夜之间大肠杆菌培养物(5毫升LB-Amp)和37°C培养物。
- 使用其他14处描述的标准协议分离质粒-DNA,执行AgeI和SpeI消化,以检查阳性克隆,并可视化1%胶合物上切出片段。垫段(128 bp)将被更大的NCCR序列(300-500 bp,见上文)所取代。
- 使用引物EGFP-N或引物对B(表1)发送桑格测序的质粒。
- 由于突变可能自发发生,因此将测序结果与与放大子获得的测序结果进行比较。仅使用包含与放大子相同的序列的克隆。
- 使用分子工作台软件(例如,免费软件 GENtle 1.9.4 或其他序列编辑程序)来对齐和编辑获取的序列(图 3)。
- 启动 GENtle 1.9.4,然后通过单击"导入"按钮(绿色向下箭头)导入 DNA 序列。
- 下一步单击"工具"并从菜单中选择"对齐"(使用 Ctrl+G 作为快捷方式),然后选择进行对齐的 DNA 序列。
- 单击"添加"或单击"删除"来删除序列,从而将序列添加到路线中。包括典型的NCCR共识序列,如JN19243815,不要使用NCCR序列从常用的邓禄普应变16,因为它有重新排列和复制其他比原型BKPyV株。
注: NCCR 已经包含平移启动通子 (图 3)。 - 通过单击工具栏中的算法来选择对齐方法,然后选择 clustal W. 将对齐参数设置为匹配 2;间隙延伸惩罚 -1;间隙惩罚 -2,然后单击"确定"以运行对齐方式。
4. HEK293T细胞随报告质粒的瞬态转染及潜在抗病毒剂治疗
- 为后续转染实验准备足够量的质粒DNA,可制备150 mL过夜培养。使用质粒分离试剂盒分离质粒DNA。或者,也可以使用其他质粒纯化试剂盒。
- 种子 1 x 105 HEK293T 细胞在 DMEM 中含有 10% FCS、青霉素和链霉素 (1x) 每孔 12 孔板 24 h 转染前 24 小时,并在 37°C 和 5% CO2孵育过夜,以保持转染过程中的活性增殖。
注:细胞在转染时应约80%的结对。 - 将250 μL减少的血清介质放入无菌管中,加入1μg每个报告员质粒DNA,并通过移液轻轻混合。
- 将3μL的转染试剂加入DNA混合物中,通过移液轻轻混合,孵育15分钟。 在使用前将转染试剂预热至22°C的环境温度,然后轻轻涡旋。
- 将混合物滴到井中,轻轻分配到井中。
- 4小时后,用含有测试剂和溶剂控制的新鲜介质替换上清液。在37°C孵育,直到分析。在此示例中,使用 mTOR 抑制剂 INK128 (100 纳克/mL) 和雷帕霉素 (100 纳克/mL)。
5. 荧光显微镜和流式细胞仪
- 在荧光显微镜下检查细胞有无红色和绿色荧光(图4)。
注:红色和绿色荧光分别对应于早期和晚期的BKPyV基因表达。 - 转染后72小时后,吸出上清液,用1mL的冷PBS洗涤细胞两次。
- 轻轻加入500 μL的胰蛋白酶,并稍微转动板,以避免细胞过早脱落。此步骤对于避免单元格双精度值非常重要。
- 加后,使用相同的移液器尖端直接取出胰蛋白酶。
- 在37°C下孵育细胞至少5分钟。
- 用含有3%FCS的1mL的PBS重新悬浮胰蛋白酶化细胞,并在预先标记的FACS管中转移悬浮液。
- 在 FACS 分析之前添加 DAPI (1 μg/mL)。
- 使用流式细胞计分析细胞。对于每个样本,测量至少 10,000 个活细胞,这些活细胞对 DAPI 染色呈阴性。
6. 数据分析
- 将数据导入流式细胞测定分析软件,并通过单击和拖动将样本添加到工作区。
- 双击导入的文件并创建图形图。单击 x 轴和 y 轴,选择 FSC-A 与 SSC-A。通过单击工具栏上的多边形并构建单元格总体(图 5) 来打开主单元格总体。根据需要命名所选单元格群(例如"单个单元格")。"单个单元格"将显示为新工作区。
- 继续对DAPI阴性(即"活细胞")进行"单细胞"的注控。要识别活细胞,可以比较有和没有DAPI染色的细胞群。在这两个图中选择 FSC-A 与太平洋蓝-A。
- 单击矩形并选择 DAPI 负单元格总体,命名所选单元格群"活细胞",并创建一个新的点图,显示 FITC (eGFP) 与 PE (tdTomato)(tdTomato)(如前所述)。
- 通过从工具栏中选择 Quad,在"活单元格"中添加象限。通过将象限的中心拖动到每个总体的边缘来对总体进行门控。象限表示 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM_, 3) eGFP_tdTOM-, 4) eGFP_tdTOM_。
注:由于 FITC 和 PE 之间的发射光谱覆盖,初始补偿对于区分红色和绿色信号以及实现准确结果至关重要。 - 通过右键单击象限并选择"添加统计信息"确定平均荧光强度 (MMIs)。选择"均值",然后单击"确定"。平均 MFI 现在显示在"统计"一节中的人口下方。象限 2 和 4 对应于早期表达式,而象限 3 和 4 表示延迟表达式。
- 以相同的方式添加其他复制以增强统计能力。
- 对于数据解释图,早期和后期的 MFI 值进入条形图:
- 要比较从不同捐赠者或病毒株获得的 NCCR 活动,请添加典型对照或 Dunlop 菌株16并将其相对 MFI 设置为 100%,并计算相对 MFI 值。对每次复制重复上述步骤,并确定均值和标准偏差。
- 要评估潜在化合物对转录活性的影响,将溶剂控制设置为100%,并绘制处理细胞的MFI。
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Representative Results
在具有代表性的实验中,通过流式细胞测定测量了BK-多瘤病毒非编码控制区驱动的转录活性。此外,一种mTOR抑制剂,可用于BKPyV重新激活后治疗患者,被测试为抑制病毒早期基因表达。为此,使用双荧光-报告器测定,如之前公布的5。实验设置的总体工作流程方案在F igure 1中进行了说明。首先,根据机构伦理委员会批准的人类研究指南,从免疫功能低下的肾脏移植患者身上采集血液样本。血液在含EDTA的管中采集,相位通过离心分离。随后,400 μL血浆用于分离多瘤病毒DNA。使用图2A所示的嵌套PCR协议放大了非编码控制区域(NCCR),使用外引基对BKV-CR-1fw和BKV-CR-1rv,以及内部引基对BKV-CR-2fw-AgeI(引基AAgeI)和BKV-CR-2rv-SpeI(引子SpeI)17,后者窝藏的AgeI和SpeI的限制网站。放大子验证是通过胶质电泳进行,如图2B所示。虽然从典型的NCCR序列(wt)衍生的放大器在凝胶中具有同质大小分布,但从重新排列的具有插入(rrins)和缺失(rr del)的NCCR衍生的放大器的大小不同(约300-500 bp)。值得注意的是,由于重新排列,作为对照的Dunlop NCCR参考序列16(DUN)大于从典型病毒中获得的NCCR。由于放大剂与预测大小相对应,纯化的PCR产物被送去进行Sanger测序,以便以后与克隆到报告质粒中的序列进行比较,以便进一步分析。
对于克隆的放大器,消化使用两个限制酶AgeI和SpeI。在使用标准克隆程序进行的双荧光报告器克隆后,通过AgeI和SpeI消化(图2C)验证了含有NCCR的阳性克隆的选择。在这里,小间隔区域(NC,128 bp)被更大的NCCR片段(约300-500bp)所取代,表明克隆为阳性。从经验证的克隆中分离出的疟原蛋白DNA被送去进行桑格测序,并与从放大子测序中获得的序列进行比较(未显示)。仅选择与放大子序列匹配的克隆进行进一步处理。如图3所示,测序结果与典型的NCCR序列(JN192438)进行了比较。在此示例中,检测到 P 块中的删除和 O 块中的替换。
为了随后测试克隆NCCR序列在细胞培养中的转录活性,HEK293T细胞通过相应的报告结构进行瞬时转染(图4A)。如图4B所示,通过荧光显微镜监测转染效率和NCCR活性。红色和绿色荧光对应于早期和晚期的BKPyV基因表达,分别5。细胞表达的荧光量表示有效的早期和晚期运动活性。正如两个例子所示,第一个NCCR(NCCR1)表现出强烈的晚期基因表达,而第二个示例(NCCR2)具有相对较强的早期但温和的晚期基因表达(图4B)。因此,为流式细胞测量准备了样品。如协议第6部分所述,DAPI负细胞被封闭(图5A,下面板),并创建一个点图,显示eGFP与tdTomato。阴性样本(图5B),以及仅对tdTomato(图5C)或eGFP(图5D)的阳性样本,都包含在分析中。注意,进行了初始补偿,这对于区分红色和绿色信号以及获得准确结果至关重要。平均荧光强度来自每个测试克隆。在这里,tdTomato阳性细胞对应于早期表达,而eGFP阳性细胞表示延迟表达。在此示例中,使用双 mTOR 抑制剂 INK128 的治疗显著减少了 tdTomato MFI(图5E-F),这意味着早期表达受到抑制。
图 1:实验设置的工作流方案。1)采集血液(替代尿液)样本,2)分离多瘤病毒DNA 3)使用嵌套PCR协议扩增非编码控制区(NCCR),4)阿加玫瑰凝胶电泳和扩增验证, 5)多氯环子的桑格测序, 6)使用 AgeI 和 SpeI 将 NCCR 克隆到双荧光报告器中,7) 选择阳性克隆,8) 桑格对质粒DNA的测序,9) HEK293T细胞的瞬态转染与报告质粒和添加化合物进行测试,10)荧光显微镜验证有效的转染,11) 流式细胞学分析,12) 门和分析eGFP tdTomato表达式,13)数据解释。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2: 嵌套PCR和患者衍生NCCR-放大器的代表性分析。A)从免疫功能低下的肾脏移植患者中提取的DNA使用与限制位点AgeI和SpeI相连的寡核苷酸引物进行半嵌套PCR扩增。BKPyV应变JN192438的原型O、P、Q、R和S-块的底向名称和长度(碱对)在括号中表示。B)在1.5%的甘草凝胶中通过电泳分析,并使用DNA染色进行可视化。M1 = 100 bp 梯子,wt = 野生型(典型),rr = 重新排列,ins = 插入,德尔= 删除,DUN = 邓禄普应变。C)与AgeI和SpeI的质粒消化。在1.5%的糖凝胶中通过电泳分析消化片段,并使用DNA染色进行可视化。M1 = 100 bp 梯子,M2 = 2 日志梯。NC = 负控制(垫片)。[ ] 正克隆。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3: 克隆和验证NCCR到双荧光报告器。质粒测序的代表性结果。使用PCR纯化试剂盒对安培康进行纯化,并进行桑格测序。各自的序列与从典型 BKPyV 应变 JN192438 派生的 NCCR 序列对齐。删除和替换以红色标记。表示 AgeI 和 SpeI 限制站点、eGFP 开放读取框的平移开始(以粗体打印)以及 NCCR 块 O-S。相应的块和限制站点以颜色突出显示。基本对中每个 NCCR 块的长度印在括号中。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:具有代表性的荧光显微镜分析早期和晚期NCCR促进者活动。A)双向启动子控制下双荧光报告器的基因图谱。如前文所述5质粒 pTA-tdTOM-NCCR-eGFP (6,009 bp) 包含 SV40 晚聚化信号,每个表达盒的下游,以确保对 tdTomato 的两种转录本进行可比和高效的处理(早期表达式)和 eGFP(延迟表达式)。NCCR的两侧是AgeI和SpeI。载体含有一个阿霉素电阻盒,用于在克隆过程中选择。B) HEK293T细胞在患者衍生NCCR序列(NCCR1-2)的控制下,用双荧光报告器结构转染。细胞在转染后72小时接受明场和荧光显微镜分析。显微镜的过滤设置用于以下激励范围:绿色表示 tdTomato (515-560 nm),蓝色用于 eGFP (450-490 nm)。比例尺 (200 μm) 表示在每个摄影的右下角。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5:代表FACS分析。图中所示为此方法所需的简单门控策略。使用双参数密度或点图。A)首先,针对太平洋蓝绘制 FSC,而仅进一步处理 DAPI 阴性(即活细胞)。B-F)绘制 FITC (eGFP) 与 PE(tdTomato)。C-D)添加纯绿色和红色荧光细胞,以调整流量细胞仪的补偿。E-F)在此示例中,mTOR 抑制剂 INK128 并显著减少 tdTomato MFI,这与减少 BKPyV 早期基因表达相对应。请点击此处查看此图的较大版本。
| 引种名称 | 序列 (5' = 3') |
| BK-CR-fwd1 | CCCAGAGCTCTTTCAAGGC |
| BK-CR-rev1 | 中委会塔阿卡亚阿亚理事会 |
| BKV-CR-2-fw-AgeI | AAAAAAACCGGTTTTTAAAATTAAAAAAAAAAAATAGG |
| BKV-CR-2-rv-SpeI | TTTTATATATCTGCGCAAACCGGCCTT |
| EGFP-N | CGTCGCCGAGCTCAGAGAG |
表 1:该协议中使用的寡核苷酸。带下划线的碱基分别表示AgeI和SpeI的限制酶位点。
| 组件 | 体积/反应 (μl) | 最终浓度 |
| 无RNase水 | 32.8 μL | - |
| 10x PCR 缓冲器 | 5 μL | 1x |
| dNTP(每10 mM) | 1 μL | 每个 dNTP 的 0.2 mM |
| Fwd-引种 (10 μM) | 3 μL | 0.3 μM |
| 改版底漆 (10 μM) | 3 μL | 0.3 μM |
| 塔克聚合酶 | 0.2 μL | 2 单位/反应 |
| 模板DNA | 5 μL | <0.5 μg/50 μL 反应 |
表 2:主混合准备协议。该说明适用于步骤 2.2 和 2.7 中分别所述的预 PCR 和嵌套 PCR 反应。
| 温度 | 时间 | PCR 步骤 | 周期 |
| 95°C | 5分钟 | 初始变性 | |
| 95°C | 30 秒 | 变性 | |
| 55°C | 34 秒 | 退火 | x35 |
| 72°C | 1 分钟 | 扩展 | |
| 72°C | 10分钟 | 最终扩展 | |
| 4°C | ∞ | 冷却 |
表 3:用于NCCR扩增的PCR程序。该说明适用于前PCR反应和嵌套PCR反应。
| 试剂 | 体积/反应 (μl) | 最终浓度 |
| 无DNase H20 | 6 | 到20μl |
| 10x 缓冲器 | 2 | 1x |
| 年龄 | 1 | 10 个单位 |
| 斯佩伊 | 1 | 10 个单位 |
| 纯化 PCR-放大子 | 10 | 变量 |
表 4:安普利翁消化方案。该指令适用于同时消化与步骤3.1中描述的两个限制性酶的Amplicon DNA。
| 试剂 | 体积/反应 (μl) | 最终浓度 |
| 无DNase H20 | 14.5 | 到20μl |
| 10x 缓冲器 | 2 | 1x |
| 年龄 | 1 | 10 个单位 |
| 斯佩伊 | 1 | 10 个单位 |
| 质粒骨干(1 μg/μL) | 1.5 | 1.5 μg |
表 5:质粒消化方案。该指令适用于同时消化质粒DNA主干与步骤3.3中描述的两个限制性酶。
| 试剂 | 体积/反应 (μl) | 最终浓度 |
| 无DNase H20 | 7 | 到20μl |
| T4 DNA连接酶 | 1 | 20 |
| 10x T4 DNA 连接酶缓冲液 | 2 | 1x |
| 纯化质粒主干 从步骤 3.5 开始,低熔胶稀释 1⁄2 |
2 | 变量 |
| 步骤 2.7 中消化和纯化的 PCR-放大剂 | 8 | 变量 |
表 6:质粒结扎协议。该说明适用于质粒DNA主干与步骤3.7中描述的消化PCR放大DNA的结扎。
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Discussion
本文提出了一种常用的方法,用于分析BKPyV非编码控制区域(NCCR)驱动的早期和后期启动器活动。NCCR活性可以同时测量,不需要转染细胞的溶解。此外,可以分析相对大量的细胞,并且不需要共同转染额外的标记,以使荧光值正常化。
此方法的一个关键部分是,克隆的 NCCR 应包含与阿普利森测序所识别的完全相同的序列,该序列对应于患者血浆中存在的大多数变体。为了获得准确的结果并尽量减少容易发生PCR的错误,强烈建议使用具有校对活性的聚合酶。或者,序列可以由商业基因合成服务订购。可订购指定的 NCCR 序列,包括用于直接克隆的侧翼 AgeI 和 SpeI 限制位点。在这种情况下,从合成结构中消化与骨干质粒平行的质粒,用相应的NCCR片段替换垫片。DNA可以从尿液样本中分离出来。然而,由于BKPyV也由免疫能力个体分泌到尿液中,不一定反映活性复制,临床相关性有限。理想情况下,DNA也可以从肾脏活检中分离出来,在活检中,以前的PVAN可以组织学检测(与Korth等人比较,2019年19)。
通过测量绿色和红色荧光细胞的平均荧光强度,该方法能够量化NCCR衍生的荧光/活性,而不会产生被测试剂的转染效率和抗增殖效应(例如,双mTOR)抑制剂INK128或PP242)5。
报告器系统的另一个应用是分析在 NCCR 中插入、删除或重复的后果,这些后果在临床分离物中发现早期和晚期的促进运动活动。在以前的研究中,对免疫抑制剂进行了研究,以调节NCCR活性;然而,没有发现突变或NCCR重排,影响易感性。然而,突变可能会影响可能在不久的将来批准的新物质的反应。
这可能是相关的,因为与编码区域大T抗原或VP1辣椒蛋白,NCCR顾名表示非编码区域,因此不作为氨基酸水平选择性压力的基础。
在此协议中,含有NCCR的阳性克隆的选择通过AgeI和SpeI消化验证。然而,菌落PCR可能代表一种替代方法,可快速筛选直接从琼脂板上的大肠杆菌插入物。对于此方法,请使用引基对 BKV-CR-2-fw-AgeI 和 EGFP-N (表 1)。转染后,使用荧光显微镜检查细胞有红色和绿色荧光(图4)。或者,在22°C下,可以使用3%PFA固定细胞20分钟。在这种情况下,用PBS清洗,在PBS中加入0.2%的非离子洗涤剂,孵育10分钟。 固定细胞可以在22°C下用PBS(1μg/mL)染色10分钟,并接受荧光显微镜分析,并在紫外线(340-380nm)下可视化。
由于两种荧光量都含有相同的聚化信号,因此可以排除聚化效率的影响。然而,与eGFP相比,tdTomato是一种二分蛋白,必须相应地转录成更长的mRNA(编码序列:分别为745比1431 bp)。然而,由于与未经处理的(DMSO)细胞相比,处理干扰物质的细胞的启动子活性总是比较,这种差异作用不大。由于复制源的存在,在细胞中稳稳地表达SV40PyV大T抗原的细胞中,报告质粒的转染允许将质粒转移到子细胞。已经表明,SV40衍生的大T抗原可以转活性SV40和BKPyVNCCR和病毒DNA复制20。然而,由于大T抗原也参与从感染的早期到晚期的过渡,给出了一个人工的情况。使用这个测定,必须考虑,最复制的限制步骤是早期表达导致大T抗原的表达。为了绘制完整的复制周期图,早期和晚期的mRNA应按qRT-PCR在受感染的细胞中测量,如其他部分5、12所述。
瑞士和德国的研究小组已经使用一种可比的方法来分析典型和重新排列的BKPyV NCCR衍生的促进运动活动,尽管具有独立克隆的载体系统5,9。戈塞特和来自巴塞尔的同事使用类似的方法确定BKPyV和JCPyV菌株9、10、11的NCCR促进者活性。两种方法都使用eGFP进行绿色荧光;然而,巴塞尔集团使用RFP,而在现行协议中tdTomato用于红色荧光。tdTomato 与 RFP 的优点是光稳定性更高;然而,二分蛋白的编码序列是RFP21的两倍。此外,蛋白质的半寿命可能不同,导致转染后浓度不均72小时。但是,此问题可能仅在直接比较两种荧光强度时才有意义。Gosert等人使用BamHI和NotI作为限制点,而在目前的协议中,AgeI和SpeI是NCCR序列的侧翼。使用这两种方法,参考DUNLOP菌株16产生了具有强早期但弱的后期促进剂活性9,10的可比荧光模式。在进一步协议中,与wt-NCCR5、9相比,NCCR-重新排列与P区域插入的插入相比,导致早期和后期促进者活动显著增加。
虽然已经表明SV40衍生的大T抗原可以转用SV40和BKPyV衍生的NCCRs20,但在未来研究中使用能稳定地表达BKPyV大T抗原的人体细胞,而不是原型病毒SV40,可能很有趣。.然而,在这种情况下,细胞系必须易于转染(例如,HEK293)。
由于多瘤病毒的NCCR促进剂非常相似,这种方法也可用于(在引物序列中具有小适应)来研究促进剂活性和强效抗病毒剂对JC-多瘤病毒(JCPyV)活性的影响。派生非编码控制区域11。由于JCPyV是渐进性多焦点白脑病(PML)的致病剂,这是一种罕见的中枢神经系统疾病,很少发生在免疫缺陷导致严重神经病理学的患者中,因此也迫切需要发现直接作用抗病毒物质,治疗免疫损害患者。有趣的是,在 JC NCCRs11中也发现了重新排列。由于JCPyV具有明显的神经对流症,因此在白酒中发现大量病毒,因此样品采集必须调整为酒源DNA。但是,后续步骤可以轻松调整。
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Disclosures
约翰内斯·科思从安斯泰来和诺华获得演讲费和旅费的赠款。马雷克·维达雷达从诺华获得顾问费。Oliver Witzke 从阿姆根、亚历克西翁、安斯泰来、巴西莱亚、比奥泰斯特、布里斯托尔-迈尔斯-斯奎布、科雷维奥、奇西、吉莱德、赫萨尔、詹森、F. 克勒·切米博士、MSD、诺华达、罗氏、罗氏、辉瑞、赛纳菲和TEVA。
Acknowledgments
作者感谢芭芭拉·布莱克曼的出色技术援助。这些研究得到了杜伊斯堡大学埃森医学院的IFORES项目以及鲁尔大学和默卡托研究中心(MERCUR)的RIMUR项目的支持。作者感谢约尔根-曼乔特-斯蒂夫通博士奖学金的海伦·塞尔兹尼格和不断的支持。患者材料的收集和使用已获得杜伊斯堡-埃森大学医学院伦理委员会的批准(14-6028-BO)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
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