Summary
In diesem Manuskript wird ein Protokoll zur FACS-basierten Messung der Transkriptionsaktivität des BK-Polyomavirus unter Verwendung von HEK293T-Zellen vorgestellt, die mit einem bidirektionalen Reporter-Plasmid transfiziert werden, das tdTomato und eGFP exzessiiert. Diese Methode ermöglicht es ferner, den Einfluss neuartiger Verbindungen auf die virale Transkription quantitativ zu bestimmen.
Abstract
Polyomaviren, wie das BK-Polyomavirus (BKPyV), können schwere Pathologien bei immungeschwächten Patienten verursachen. Da jedoch derzeit keine hochwirksamen antiviralen Mittel verfügbar sind, sind Methoden erforderlich, die die Wirkung potenzieller antiviraler Wirkstoffe messen. Hier wurde ein Dual-Fluoreszenz-Reporter konstruiert, der die Analyse der BKPyV-Nicht-Kodierungs-Kontrollregion (NCCR) ermöglicht, die früh und spät epromoternde Aktivität angetrieben hat, um die Auswirkungen potenzieller antiviraler Medikamente auf die virale Genexpression über tdTomato und eGFP zu quantifizieren. ausdruck. Darüber hinaus können durch das Klonen von BKPyV-NCCR-Amplonikern, die in diesem Protokoll exemplarisch aus der blutabgeleiteten DNA immungeschwächter renaltransplantierter Patienten gewonnen wurden, die Auswirkungen von NCCR-Umlagerungen auf die virale Genexpression bestimmt werden. Nach dem Klonen der vom Patienten abgeleiteten Amplika wurden HEK293T-Zellen mit den Reporter-Plasmiden transfiziert und mit potenziellen antiviralen Wirkstoffen behandelt. Anschließend wurden die Zellen einer FACS-Analyse unterzogen, um die mittleren Fluoreszenzintensitäten 72 h nach der Transfektion zu messen. Um auch die Analyse von Medikamenten zu testen, die eine potentielle zellzyklushemmende Wirkung haben, werden nur transfizierte und damit fluoreszierende Zellen verwendet. Da dieser Test in großen T-Antigen-Expressionszellen durchgeführt wird, können die Auswirkungen der frühen und späten Expression auf gegenseitig unabhängige Weise analysiert werden.
Introduction
Polyomaviren stellen eine unabhängige Familie kleiner doppelsträngiger DNA-Viren (dsDNA) dar, wobei das Simian-Virus 40 (SV40) als Prototypart existiert. Die primäre Infektion tritt vor allem während der Kindheit, die in der Regel ohne Krankheitssymptome und in der Regel latente Infektionen bei immunkompetenten Wirten verursachen. Das BK-Polyomavirus (BKPyV) bleibt hauptsächlich in Nierentubulizellen ohne Nephropathologien fort, kann jedoch im Falle einer Beeinträchtigung der Immunkompetenz nach einer Nierentransplantation reaktivieren und schwere Schäden und beeinträchtigte Transplantate verursachen. bei Erreichen einer hohen Virämie (1 x 104 BKPyV DNA-Kopien/ml)1,2. Bei etwa 10% der Nierentransplantationsempfänger führt die Reaktivierung des BK-Polyomavirus (BKPyV) zu einer Polyomavirus-assoziierten Nephropathie (PyVAN), die mit einem hohen Risiko für Renal-Allograft-Ausfällen verbunden war3,4 . Da keine zugelassenen antiviralen Wirkstoffe verfügbar sind, basiert die aktuelle Therapie auf der Reduktion der Immunsuppression. Interessanterweise scheinen mTOR-Hemmer eine antivirale Wirkung zu haben; Daher könnte die Umstellung der immunsuppressiven Therapie auf mTOR-basierte Immunsuppression einen alternativen Ansatz darstellen, um das Fortschreiten der BKPyV-Virämie5,6,7zu verhindern. Der mTOR-basierte antivirale Mechanismus ist derzeit jedoch noch nicht vollständig verstanden. Daher sind Methoden zur Messung der Wirkung potenzieller antiviraler Wirkstoffe in klinisch relevanten Konzentrationen erforderlich.
Das kreisförmige Genom des BKPyV besteht aus ca. 5 kb, die eine nicht-kodierende Kontrollregion (NCCR) beherbergen, die als Ursprung der Replikation dient und gleichzeitig als bidirektionaler Promotor, der die Expression von mRNA-Transkripten der frühen und späten Phase antreibt. Da spontan auftretende NCCR-Umlagerungen, Deletionen und Duplizierungen bei pathogenen BKPyV8 gefunden und bei Patienten mit PVAN5,9signifikant angesammelt werden, wird ein Vergleich von archetypischen (wt) und neu arrangierte (rr) NCCR-Aktivitäten sind hilfreich, um virale reproduziertive Fitness zu charakterisieren.
Wie in Abbildung 1zusammengefasst, beschreibt dieses Protokoll eine häufig verwendete Methode zur Messung der BKPyV NCCR-Transkriptionsaktivität durch Quantifizierung der Fluoreszenz von zwei Fluorophoren tdTomato und eGFP, ausgedrückt aus einem Reporterplasmid5, 9,10,11. Das Verfahren wird in Gegenwart des SV40 large T Antigens (lTAg) durchgeführt, das es ermöglicht, die Auswirkungen potenzieller antiviraler Wirkstoffe auf die frühe und späte NCCR-Aktivität separat zu analysieren5. Dieser Assay analysiert weiter die Auswirkungen von Umlagerungen auf die NCCR-Aktivität und vergleicht mit wt-NCCRs5,9. Das Reporter-Plasmid enthält das SV40-Spätpolyadenylierungssignal nach jedem offenen Leserahmen des Fluorophors, um eine vergleichbare und effiziente Verarbeitung beider Transkripte für tdTomato bzw. eGFP zu gewährleisten. Im Vergleich zu den qRT-PCR-basierten Methoden5,12stellt dieser FACS-basierte Ansatz eine kostengünstige und hohe Durchsatz-kompatible Alternative dar, da keine komplizierten Extraktionsprotokolle für infizierte Zellkultur und keine teuren Antikörper für Immunfluoreszenzfärbung sind erforderlich. Da darüber hinaus eine definierte Menge an fluoreszierenden Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert wird, ist die Analyse von Zellzyklushemmungsmitteln auch quantitativ möglich.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Humanforschung, die vom Ethikausschuss der Medizinischen Fakultät der Universität Duisburg-Essen (14-6028-BO) gebilligt wurden.
1. Entnahme von Blut- oder Urinproben und Isolierung der Polyomavirus-DNA
- Sammeln Sie mindestens 3 ml Blut in EDTA-Röhrchen oder Urin in Anschaffungsröhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 2.500 x g für 15 min. Bei Bedarf Pipettenplasma in eine neue Röhre geben und die Plasmaproben mehrere Tage bei 4 °C lagern oder bei -20 °C für eine längere Lagerung einfrieren.
- Bereiten Sie 40 l Proteinase K in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr vor und fügen Sie 400 l Plasma durch Pipettieren hinzu.
- Lyse die Probe durch Zugabe von 400 l Lysepuffer, Wirbel für 15 s, und inkubieren für 10 min bei 56 °C.
- Isolieren Sie die DNA mit einem DNA-Blutextraktionskit, wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben. Kurz gesagt, fügen Sie Alkohol hinzu und laden Sie die Lysate auf eine Spin-Säule, die eine DNA-bindende Kieselsäure-basierte Membran enthält. Waschen Sie die Säulen mehrmals, um reine DNA zu ergeben.
- Elute die ergab DNA in 30-50 l TE Puffer.
2. Verstärkung des nicht kodierenden Kontrollbereichs (NCCR)
- Führen Sie das folgende Verfahren in physisch getrennten Räumen aus. Verwenden Sie einen isolierten Raum, um die Reagenzien vorzubereiten und die Mischung an die PCR-Röhren zu verteilen.
- Bereiten Sie den Master Mix für die Pre-PCR mit dem Primerpaar A (Tabelle 1) in einem Gesamtvolumen von 50 l vor und verwenden Sie die zuvor isolierte DNA aus Schritt 1.6. Das Pipettierschema zum Vorbereiten des Master-Mix für die vor und geschachtelte PCR ist in Tabelle 2gedruckt.
- Verteilen Sie 45 l des Master-Mix in die PCR-Röhren.
- Fügen Sie 5 l der isolierten DNA in die PCR-Röhren ein.
HINWEIS: Verwenden Sie einen anderen Raum als den für die Master-Mix-Vorbereitung, um Eine Kontamination zu vermeiden. - Führen Sie die PCR mit den Reaktionsbedingungen aus, wie in Tabelle 3dargestellt. Wiederholen Sie Denaturierung, Glühen und Verlängerung in 35 Zyklen.
- Für die verschachtelte Verstärkung verwenden Sie das Primerpaar B, das die Restriktionsstandorte für AgeI und SpeI enthält (Tabelle 1).
- Führen Sie die verschachtelte PCR mit den Reaktionsbedingungen aus, wie in den Schritten 2.2 bis 2.5 beschrieben, mit 5 l der Vor-PCR.
- Mischen Sie 10 l des PCR-Produkts mit 2 l 6x Gel-Ladefarbstoff. 10 l der Mischung auf ein 1,5% Agarose-Gel geben und das Gel 30 min bei 60 mA laufen lassen.
- Visualisieren Sie das Gel mit einem geeigneten UV-Dokumentationssystem.
HINWEIS: Die Größe des Amplicons wird voraussichtlich zwischen 300-500 bp liegen, je nachdem, ob Umlagerungen (Deletionen, Einfügungen oder Duplizierungen) aufgetreten sind (Abbildung 2C). - Reinigen Sie die PCR-Amplicons mit einem PCR-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Elute die PCR-Amplicons in 30 L Elutionspuffer.
- Senden Sie die Amplicons für die Sanger-Sequenzierung mit dem Primerpaar B.
3. Klonen des NCCR in den Dual-Fluoreszenz-Reporter
- Verdauen Sie die gereinigten Amplicons (Schritt 2.10) mit AgeI und SpeI für 2 h bei 37 °C, wie in Tabelle 4beschrieben.
- Wiederholen Sie Schritt 2.10 und reinigen Sie die verdauten Amplicons.
- Verdauen Sie parallel auch das Plasmid-Rückgrat (1,5 g) mit AgeI und SpeI für 2 h bei 37 °C, wie in Tabelle 5beschrieben. Dieser Schritt muss nur einmal ausgeführt werden. Für nachfolgende Reaktionen die Verdauung bei -20 °C einfrieren.
- Analysieren Sie das verdaute Plasmid-Rückgrat auf einem 0,8% niedrigen Schmelzagarose-Gel.
HINWEIS: Führen Sie das Gel nicht mit einem Strom von mehr als 40 mA aus. Die erwartete Einfügung des Spacer-Bereichs, der ursprünglich vom Plasmid pEX-K4 2-LTR CD313 abgeleitet wurde, beträgt 128 bp (Abbildung 2C). - Visualisieren Sie DNA-Fragmente mit langwelligem UV-Licht (320 nm) und schneiden Sie das Rückgratband mit einem sauberen Skalpell aus. Übertragen Sie das niedrige Schmelzgelfragment in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Vermeiden Sie lange UV-Belichtungszeiten, um DNA-Schäden zu verhindern.
HINWEIS: Da niedrige Schmelzagarose verwendet wird, ist es nicht notwendig, die DNA vor der Ligation zu reinigen. - Das Rückgrat mit dem schwachschmelzenden Agarose-Stück 10 min bei 65 °C erhitzen, um das Gelstück zu schmelzen und alle 2 min durch sanftes Wirbeln zu mischen. Das geschmolzene Gel kann direkt zur Ligation verwendet werden.
- Ligate das Rückgrat und das verdaute Amplicon mit T4 DNA Ligase über Nacht bei 16 °C mit dem Schema in Tabelle 6gezeigt .
- Führen Sie die Umwandlung in E. coli mit der Hitzeschockmethode, Plattenbakterien auf LB-Amp-Platten und Kultur bei 37 °C über Nacht durch.
- Wählen Sie am nächsten Tag drei positive Klone aus und bereiten über Nacht E. coli-Kulturen (5 ml LB-Amp) und Kultur bei 37 °C vor.
- Isolieren Sie die Plasmid-DNA mit Standardprotokollen, wie an anderer Stelle beschrieben14, führen Sie AgeI und SpeI Verdauung, um auf positive Klone zu überprüfen und visualisieren ausgeschnittene Fragmente auf einem 1% Agarose Gel. Das Abstandsband (128 bp) wird durch die größere NCCR-Sequenz (300-500 bp, siehe oben) ersetzt.
- Senden Sie das Plasmid für die Sanger-Sequenzierung mit Primer EGFP-N oder Primerpaar B (Tabelle 1).
- Da Mutationen spontan auftreten können, vergleichen Sie die Sequenzierungsergebnisse mit den Sequenzierungsergebnissen, die mit dem Amplikon erzielt wurden. Verwenden Sie nur die Klone, die im Vergleich zum Amplikon identische Sequenzen enthalten.
- Verwenden Sie eine molekulare Workbench-Software (z. B. Freeware GENtle 1.9.4 oder andere Sequenzbearbeitungsprogramme), um die erhaltenen Sequenzen auszurichten und zu bearbeiten (Abbildung 3).
- Starten Sie GENtle 1.9.4 und importieren Sie die DNA-Sequenzen, indem Sie auf den Import-Button (grüner Pfeil nach unten) klicken.
- Klicken Sie als nächstes auf Werkzeug und wählen Sie Ausrichtung aus dem Menü (Verwenden Sie Strg+G als Verknüpfung) und wählen Sie die DNA-Sequenzen für die Ausrichtung.
- Fügen Sie der Ausrichtung eine Sequenz hinzu, indem Sie auf Hinzufügen oder Entfernen einer Sequenz klicken, indem Sie auf Entfernenklicken. Schließen Sie eine archetypische NCCR-Konsenssequenz wie JN19243815ein, verwenden Sie nicht die NCCR-Sequenz aus dem häufig verwendeten Dunlop-Stamm16, da sie Umlagerungen und Duplizierungen anderer als die archetypische BKPyV enthält Stämme.
HINWEIS: Die NCCR enthält bereits das translationale Startcodon (Abbildung 3). - Wählen Sie eine Methode für die Ausrichtung, indem Sie in der Symbolleiste auf Algorithmus klicken und clustal W auswählen. Legen Sie die Ausrichtungsparameter so fest, dass sie 2 entsprechen; Spaltverlängerungsstrafe -1; Spaltstrafe -2 und klicken Sie auf OK, um die Ausrichtung auszuführen.
4. Transiente Transfektion von HEK293T-Zellen mit dem Reporterplasmid und Behandlung mit potenziellen antiviralen Wirkstoffen
- Um ausreichende Mengen an Plasmid-DNA für nachfolgende Transfektionsexperimente vorzubereiten, wird eine 150 ml Übernachtkultur vorbereitet. Isolieren Sie die Plasmid-DNA mit einem Plasmid-Isolationskit. Alternativ können auch andere Plasmid-Reinigungskits verwendet werden.
- Samen 1 x 105 HEK293T-Zellen in DMEM, die 10% FCS, Penicillin und Streptomycin (1x) pro Bohrung einer 12-Well-Platte 24 h vor der Transfektion enthalten und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren, um die aktive Proliferation während der Transfektion aufrechtzuerhalten.
HINWEIS: Zellen sollten bei der Transfektion etwa 80 % konfluent sein. - Legen Sie 250 l reduziertes Serummedium in eine sterile Röhre und fügen Sie 1 g jeder Reporter-Plasmid-DNA hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren.
- Fügen Sie dem DNA-Gemisch 3 l des Transfektionsreagenzes hinzu, mischen Sie es vorsichtig durch Pipettieren und inkubieren Sie 15 min. Das Transfektionsreagenz vor der Umgebungstemperatur von 22 °C vorerwärmen und vor Gebrauch sanft wirbeln.
- Fügen Sie die Mischung tropfenweise in die Brunnen und verteilen Sie vorsichtig auf den Brunnen.
- Nach 4 h den Überstand durch ein frisches Medium ersetzen, das die Prüfmittel und die Lösungsmittelkontrolle enthält. Bei 37 °C bis zur Analyse inkubieren. In diesem Beispiel wurden die mTOR-Inhibitoren INK128 (100 ng/mL) und Rapamycin (100 ng/mL) verwendet.
5. Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie
- Überprüfen Sie Zellen auf die rote und grüne Fluoreszenz unter dem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 4).
HINWEIS: Rote und grüne Fluoreszenz entsprechen der frühen bzw. späten BKPyV-Genexpression. - Nach 72 h nach der Transfektion den Überstand aspirieren und die Zellen zweimal mit 1 ml kaltem PBS waschen.
- Fügen Sie vorsichtig 500 l Trypsin hinzu und drehen Sie die Platte leicht, um eine vorzeitige Ablösung der Zellen zu vermeiden. Dieser Schritt ist wichtig, um Zelldoublets zu vermeiden.
- Nach dem Hinzufügen entfernen Sie das Trypsin direkt mit der gleichen Pipettespitze.
- Inkubieren Sie die Zellen für mindestens 5 min bei 37 °C.
- Trypsinisierte Zellen mit 1 ml PBS, die 3% FCS enthalten, wieder aufsetzen und die Suspension in vorbeschriftete FACS-Rohre übertragen.
- Fügen Sie vor der FACS-Analyse DAPI (1 g/ml) hinzu.
- Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer. Messen Sie für jede Probe mindestens 10.000 lebende Zellen, die für die DAPI-Färbung negativ sind.
6. Datenanalyse
- Importieren Sie die Daten in die Flow-Zytometrie-Analysesoftware, und fügen Sie Beispiele per Klick und Drag in den Arbeitsbereich hinzu.
- Doppelklicken Sie auf die importierte Datei und erstellen Sie ein Diagrammdiagramm. Wählen Sie FSC-A gegen SSC-A, indem Sie auf die x- und y-Achse klicken. Gate die Hauptzellpopulation, indem Sie auf Polygon in der Symbolleiste klicken und die Zellpopulation umrahmen (Abbildung 5). Benennen Sie die ausgewählte Zellpopulation nach Bedarf (z. B. "einzelne Zellen"). Die "einzelnen Zellen" werden als neuer Arbeitsbereich angezeigt.
- Fahren Sie mit dem Gating "einzelne Zellen" für DAPI-Negativ (d. h. "lebende Zellen") fort. Um lebende Zellen zu identifizieren, vergleichen Sie die Zellpopulation mit und ohne DAPI-Färbung. Wählen Sie in beiden Parzellen FSC-A versus pacific-blue-A.
- Klicken Sie auf das Rechteck und wählen Sie die negative DAPI-Zellpopulation, benennen Sie die ausgewählte Zellpopulation als "lebende Zellen" und erstellen Sie ein neues Punktdiagramm, das FITC (eGFP) im Vergleich zu PE (tdTomato) wie zuvor beschrieben zeigt.
- Fügen Sie Quadranten in "lebende Zellen" hinzu, indem Sie Quad aus der Symbolleiste auswählen. Gate die Bevölkerung, indem Sie die Mitte des Quadranten an den Rand jeder Bevölkerung ziehen. Die Quadranten stellen 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM+, 3) eGFP+tdTOM-, 4) eGFP+tdTOM+ dar.
HINWEIS: Aufgrund der spektralen Überlagerung von Emissionsspektren zwischen FITC und PE ist eine anfängliche Kompensation unerlässlich, um zwischen roten und grünen Signalen zu unterscheiden und genaue Ergebnisse zu erzielen. - Bestimmen Sie die mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFI), indem Sie mit der rechten Maustaste auf den Quadranten klicken und Statistik hinzufügenauswählen. Wählen Sie Mittelwert und klicken Sie auf OK. Das mittlere MFI wird nun unterhalb der Bevölkerung im Abschnitt "Statistik" angezeigt. Quadranten 2 und 4 entsprechen dem frühen Ausdruck, während quadranten 3 und 4 einen späten Ausdruck darstellen.
- Fügen Sie zusätzliche Replikationen auf die gleiche Weise für die statistische Leistung hinzu.
- Für Dateninterpretationsdiagramm MFI-Werte von früh und spät in ein Balkendiagramm:
- Um NCCR-Aktivitäten von verschiedenen Spendern oder Virusstämmen zu vergleichen, fügen Sie eine archetypische Kontrolle oder den Dunlop-Stamm16 hinzu, und legen Sie ihre relativen MFIs auf 100 % fest, und berechnen Sie die relativen MFI-Werte. Wiederholen Sie dies mit jeder Replikation und bestimmen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung.
- Um eine Wirkung potenzieller Verbindungen auf die Transkriptionsaktivität zu bewerten, stellen Sie die Lösungsmittelkontrolle auf 100% ein und zeichnen Sie das MFI der behandelten Zellen auf.
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Representative Results
In diesem repräsentativen Experiment wurde die von BK-Polyomavirus Non-Coding Control Region gesteuerte Transkriptionsaktivität mittels Durchflusszytometrie gemessen. Darüber hinaus wurde ein mTOR-Hemmer, der zur Behandlung von Patienten nach BKPyV-Reaktivierung eingesetzt werden könnte, auf seine Hemmung der viralen frühen Genexpression getestet. Zu diesem Zweck wurde ein dualer Fluoreszenz-Reporter-Assay verwendet, wie zuvor veröffentlicht5. Das gesamte Workflow-Schema des Versuchsaufbaus ist in Figure 1dargestellt. Zunächst wurden Blutproben von immungeschwächten nierentransplantatierten Patienten gemäß den Richtlinien der Humanforschung entnommen, die von der institutionellen Ethikkommission genehmigt wurden. Das Blut wurde in EDTA-haltigen Röhrchen entnommen und die Phasen wurden durch Zentrifugation getrennt. Anschließend wurden 400 l Plasma zur Isolierung der Polyomavirus-DNA verwendet. Der nicht kodierende Kontrollbereich (NCCR) wurde mit einem verschachtelten PCR-Protokoll verstärkt, wie in Abbildung 2A dargestellt, mit dem äußeren Primerpaar BKV-CR-1fw und BKV-CR-1rv sowie dem inneren Primerpaar BKV-CR-2fw-AgeI (Primer AgeI) und BKV-CR-2rv-SpeI ( Primer SpeI)17, letzteres beherbergt die Restriktionsgebiete für AgeI und SpeI. Die Amplikonverifizierung erfolgte über die Agarose-Gelelektrophorese, wie in Abbildung 2Bdargestellt. Während die aus archetypischen NCCR-Sequenzen (wt) abgeleiteten Amplicons eine homogene Größenverteilung im Gel aufwiesen, unterschieden sich die aus neu angeordneten NCCRs mit Einfügungen (rrins) und Deletionen (rrdel) in ihrer Größe (ca. 300-500 bp). Insbesondere war die Dunlop NCCR-Referenzsequenz16 (DUN), die als Kontrolle enthalten war, aufgrund von Umlagerungen größer als die NCCR, die aus archetypischen Viren gewonnen wurde. Da die Amplicons den vorhergesagten Größen entsprachen, wurden die gereinigten PCR-Produkte zur Sanger-Sequenzierung zur späteren Vergleich mit den Sequenzen geschickt, die zur weiteren Analyse in das Reporterplasmid geklont wurden.
Zum Klonen der Amplicons wurde die Verdauung mit den beiden Restriktionsenzymen AgeI und SpeI durchgeführt. Nach dem Klonen in den Dual-Fluoreszenz-Reporter, der mit Standard-Klonverfahren durchgeführt wurde, wurde die Auswahl positiver Klone, die die NCCR enthalten, durch AgeI- und SpeI-Verdauung überprüft (Abbildung 2C). Hier wurde der kleine Abstandsbereich (NC, 128 bp) durch die größeren NCCR-Fragmente (ca. 300-500 bp) ersetzt, die positive Klone anzeigen. Plasmid-DNA, die aus verifizierten Klonen isoliert wurde, wurde zur Sanger-Sequenzierung gesendet und mit den Sequenzen verglichen, die bei der Amplicon-Sequenzierung gewonnen wurden (nicht gezeigt). Für die weitere Verarbeitung wurden nur die Klone ausgewählt, die der Amplicon-Sequenz entsprechen. Wie in Abbildung 3dargestellt, wurden die Sequenzierungsergebnisse mit einer archetypischen NCCR-Sequenz (JN192438) verglichen. In diesem Beispiel wurden ein Löschen im P-Block und eine Ersetzung im O-Block erkannt.
Um anschließend die Transkriptionsaktivität der geklonten NCCR-Sequenzen in der Zellkultur zu testen, wurden HEK293T-Zellen vorübergehend mit den jeweiligen Reporterkonstrukten transfiziert (Abbildung 4A). Wie in Abbildung 4Bvisualisiert, wurden die Transfektionseffizienz und ncCR-Aktivität mittels Fluoreszenzmikroskopie überwacht. Rote und grüne Fluoreszenz entsprachen der frühen und späten BKPyV-Genexpression bzw.5. Die Zellen exprimierten beide Fluorophore, die auf eine effiziente frühe und späte promotorische Aktivität hindeuteten. Wie die beiden Beispiele zeigen, zeigte die erste NCCR (NCCR1) eine starke späte Genexpression, während das zweite Beispiel (NCCR2) eine vergleichsweise starke frühe, aber moderate Spätgenexpression aufwies (Abbildung 4B). So wurden Proben für die Durchflusszytometriemessung vorbereitet. Wie in Protokollabschnitt 6 beschrieben, wurden DAPI-Negativzellen abgegrenzt (Abbildung5A, untere Fläche) und ein Punktdiagramm mit eGFP im Vergleich zu tdTomato erstellt. In die Analyse wurden Nur negative Stichproben (Abbildung 5B) sowie solche, die nur für tdTomato (Abbildung 5C) oder eGFP (Abbildung 5D) positiv waren, in die Analyse einbezogen. Hinweis, erste Kompensation durchgeführt wurde, die wichtig ist, um rote und grüne Signale zu unterscheiden und genaue Ergebnisse zu erzielen18. Aus jedem Testklon wurden mittlere Fluoreszenzintensitäten abgeleitet. Hier entsprachen tdTomato-positive Zellen der frühen Expression, während eGFP-positive Zellen eine späte Expression darstellten. In diesem Beispiel reduzierte die Behandlung mit dem Dual-mTOR-Hemmer INK128 tdTomato MFI (Abbildung 5E-F), was bedeutet, dass die frühe Expression gehemmt wurde.
Abbildung 1 : Workflowschema für den Versuchsaufbau. 1) Entnahme von Blutproben (alternativ Urin), 2) Isolierung der Polyomavirus-DNA 3) Verstärkung des nicht kodierenden Kontrollbereichs (NCCR) mit einem verschachtelten PCR-Protokoll, 4) Agarose-Gel-Elektrophorese und Amplikon Verifikation, 5) Sanger-Sequenzierung des PCR-Amplicons, 6) Klonen des NCCR in den Dual-Fluoreszenz-Reporter mit AgeI und SpeI, 7) Auswahl positiver Klone, 8) Sanger-Sequenzierung der Plasmid-DNA, 9) Transiente Transfektion von HEK293T-Zellen mit dem Reporterplasmid und Zugabe von zu prüfenden Verbindungen, 10) Fluoreszenzmikroskopie zur Überprüfung der effizienten Transfektion, 11) Durchflusszytometrie-Analyse, 12) Gating und Analyse des eGFP tdTomato-Ausdrucks, 13) Dateninterpretation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Verschachtelte PCR und repräsentative Analyse von Patienten abgeleiteten NCCR-Amplicons. A) DNA, die von immungeschwächten renalen transplantierten Patienten gewonnen wurde, wurde einer halbverschachtelten PCR-Amplifikation mit Oligonukleotid-Primern unterzogen, die mit den Restriktionsstellen AgeI und SpeI verknüpft waren. Primernamen und Länge (Basispaare) von archetypischen O-, P-, Q-, R- und S-Blöcken aus BKPyV-Stamm JN192438 sind in Klammern angegeben. B) Amplicons wurden durch Elektrophorese in 1,5% Agarose-Gel analysiert und mittels DNA-Färbung visualisiert. M1 = 100 bp Leiter, wt = Wildtyp (archetypisch), rr = neu angeordnet, ins = Einfügungen, del= Deletionen, DUN = Dunlop Strain. C) Plasmidverdauung mit AgeI und SpeI. Verdaut fragmentierte Fragmente wurden durch Elektrophorese in 1,5% Agarose-Gel analysiert und mittels DNA-Färbung visualisiert. M1 = 100 bp Leiter, M2 = 2-LogLeiter. NC = Negativkontrolle (Spacer). + = positiver Klon. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Klonen und Validierung des NCCR in den Dual-Fluoreszenz-Reporter. Repräsentative Ergebnisse der Plasmidsequenzierung. Amplicons wurden mit einem PCR-Reinigungskit gereinigt und der Sanger-Sequenzierung unterzogen. Die jeweiligen Sequenzen wurden an der NCCR-Sequenz aus dem archetypischen BKPyV-Stamm JN192438 ausgerichtet. Löschungen und Ersetzungen sind rot markiert. Die AgeI- und SpeI-Beschränkungsseiten, der translationale Start des offenen eGFP-Leserahmens (fett gedruckt) sowie die NCCR-Blöcke O-S sind angegeben. Die jeweiligen Blöcke und die Einschränkungsstellen werden farblich hervorgehoben. Die Länge jedes NCCR-Blocks in Basispaaren wird in Klammern gedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Repräsentative Fluoreszenzmikroskopie-Analyse der frühen und späten NCCR-Promotoraktivität. A) Genkarte des Dualfluoreszenzreporters unter der Kontrolle des bidirektionalen Promotors. Wie bereitsbeschrieben 5, beherbergt das Plasmid pTA-tdTOM-NCCR-eGFP (6.009 bp) das SV40-Spätpolyadenylierungssignal nach jeder Expressionskassette, um eine vergleichbare und effiziente Verarbeitung beider Transkripte für tdTomato (frühe Expression) bzw. eGFP (Spätausdruck). NCCR wird von AgeI und SpeI flankiert. Der Vektor enthält eine Ampicillin-Widerstandskassette zur Auswahl während des Klonvorgangs. B) HEK293T-Zellen wurden mit Dual-Fluoreszenz-Reporterkonstrukten transfiziert, die jeweils unter der Kontrolle von vom Patienten abgeleiteten NCCR-Sequenzen (NCCR1-2) stehen. Die Zellen wurden einer Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie-Analyse 72 h nach der Transfektion unterzogen. Die Filtereinstellungen des Mikroskops wurden in den folgenden Anregungsbereichen verwendet: grün für tdTomato (515-560 nm) und blau für eGFP (450-490 nm). Der Maßstabsbalken (200 m) ist unten rechts auf jeder Fotografie angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 : Repräsentative FACS-Analyse. Gezeigt wird die einfache Gating-Strategie, die für diese Methode erforderlich ist. Es werden Zweiparameterdichte- oder Punktdiagramme verwendet. A) Erstens wird FSC gegen Pacific Blue geplottet, während nur DAPI-negativ (d. h. lebende Zellen) weiterverarbeitet werden. B-F) FITC (eGFP) versus PE (tdTomato) werden geplottet. C-D) Fügen Sie ausschließlich grüne und rote Fluoreszenzzellen hinzu, um die Kompensation auf dem Durchflusszytometer anzupassen. E-F) In diesem Beispiel reduziert der mTOR in InK128 und reduziert das tdTomato MFI signifikant, was einer Reduktion der BKPyV-Frühgenexpression entspricht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Primername | Sequenz (5' bei 3') |
| BK-CR-fwd1 | CCCAGGCAGCTCTCTAAGGC |
| BK-CR-rev1 | CCTCTAACAAAATCCAGCAAAAGC |
| BKV-CR-2-fw-AgeI | AAAAAAACCGGT TTTTGCAAAAATTGCAAAAGAATAGG |
| BKV-CR-2-rv-SpeI | TTTTTTACTAGTCTGGCGCAGAACCATGGCCTT |
| EGFP-N | CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG |
Tabelle 1: Oligonukleotide, die in diesem Protokoll verwendet werden. Die unterstrichenen Basen zeigen die Restriktionsenzyme für AgeI bzw. SpeI an.
| teil | Volumen/Reaktion (l) | Endkonzentration |
| RNasefreies Wasser | 32,8 l | - |
| 10x PCR-Puffer | 5 l | 1x |
| dNTPs (jeweils 10 mM) | 1 L | 0,2 mM von jedem dNTP |
| Fwd-Primer (10 m) | 3 l | 0,3 m |
| Rev-Primer (10 m) | 3 l | 0,3 m |
| Taq Polymerase | 0,2 l | 2 Einheit/Reaktion |
| Template-DNA | 5 l | <0,5 g/50 l Reaktion |
Tabelle 2: Master-Mix-Vorbereitungsprotokoll. Die Anweisung gilt sowohl für vor- als auch für verschachtelte PCR-Reaktionen, wie in den Schritten 2.2 und 2.7 beschrieben.
| temperatur | dauer | PCR-Schritt | Zyklen |
| 95°C | 5 Min. | Anfängliche Denaturierung | |
| 95°C | 30 Sek. | Denaturierung | |
| 55°C | 34 Sek. | Glühen | x35 |
| 72°C | 1 Min. | anbau | |
| 72°C | 10 Min. | Endgültige Verlängerung | |
| 4°C | ∞ | kühlend |
Tabelle 3: PCR-Programm für NCCR-Verstärkung. Die Anweisung gilt sowohl für vor- als auch für verschachtelte PCR-Reaktionen.
| Reagenz | Volumen/Reaktion (l) | Endkonzentration |
| DNase-frei H20 | 6 | bis zu 20 l |
| 10x Puffer | 2 | 1x |
| AgeI | 1 | 10 Stück |
| Spei | 1 | 10 Stück |
| gereinigtes PCR-Amplikon | 10 | veränderlich |
Tabelle 4: Amplicon-Verdauungsprotokoll. Die Anweisung gilt für die gleichzeitige Verdauung der Amplicon-DNA mit zwei in Schritt 3.1 beschriebenen Restriktionsenzymen.
| Reagenz | Volumen/Reaktion (l) | Endkonzentration |
| DNase-frei H20 | 14,5 | bis zu 20 l |
| 10x Puffer | 2 | 1x |
| AgeI | 1 | 10 Stück |
| Spei | 1 | 10 Stück |
| Plasmid-Rückgrat (1 g/l) | 1.5 | 1,5 g |
Tabelle 5: Plasmid-Verdauungsprotokoll. Die Anweisung gilt für die gleichzeitige Verdauung des Plasmid-DNA-Rückgrats mit zwei in Schritt 3.3 beschriebenen Restriktionsenzymen.
| Reagenz | Volumen/Reaktion (l) | Endkonzentration |
| DNase-frei H20 | 7 | bis zu 20 l |
| T4 DNA-Ligase | 1 | 20 |
| 10x T4 DNA Ligase Puffer | 2 | 1x |
| Gereinigtes Plasmid-Rückgrat Niedrige Schmelze verdünnt 1/2 aus Schritt 3.5 |
2 | veränderlich |
| Verdaut und gereinigtPCR-Amplikon ab Schritt 2.7 | 8 | veränderlich |
Tabelle 6: Plasmid-Ligationsprotokoll. Die Anweisung gilt für die Ligation des Plasmid-DNA-Rückgrats mit der in Schritt 3.7 beschriebenen verdauten PCR-Amplikon-DNA.
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Discussion
In diesem Artikel wird eine häufig verwendete Methode vorgestellt, die die Analyse der BKPyV-Nicht-Kodierungssteuerungsregion (NCCR) ermöglicht, die von einer frühen und späten Promotoraktivität getrieben wird. Die NCCR-Aktivität kann gleichzeitig gemessen werden und benötigt keine Lyse der transfizierten Zellen. Darüber hinaus kann eine relativ große Anzahl von Zellen analysiert werden und die Ko-Transfektion zusätzlicher Marker zur Normalisierung der Fluoreszenzwerte ist nicht notwendig.
Ein kritischer Teil dieser Methode ist, dass die geklonte NCCR genau die gleichen Sequenzen enthalten sollte, wie sie durch die Amplicon-Sequenzierung identifiziert werden, was den Mehrheitsvarianten im Patientenplasma entspricht. Um genaue Ergebnisse zu erzielen und PCR-anfällige Fehler zu minimieren, wird dringend empfohlen, eine Polymerase mit Proof-Leseaktivität zu verwenden. Alternativ können Sequenzen nach kommerziellen Gensynthesediensten bestellt werden. Die ausgewiesenen NCCR-Sequenzen können bestellt werden, einschließlich flankierender AgeI- und SpeI-Beschränkungsstandorte für das direkte Klonen. Verdauen Sie in diesem Fall das Plasmid parallel zum Backbone-Plasmid und ersetzen Sie den Abstands-Einsatz durch das entsprechende NCCR-Fragment aus dem synthetisierten Konstrukt. DNA kann alternativ aus Urinproben isoliert werden. Da BKPyV jedoch auch von immunkompetenten Personen in den Urin abgesondert wird und nicht unbedingt eine aktive Replikation widerspiegelt, ist die klinische Relevanz begrenzt. Idealerweise kann die DNA auch aus Nierenbiopsien isoliert werden, bei denen zuvor PVAN histologisch nachgewiesen werden konnte (vergleiche mit Korth et al., 201919).
Durch die Messung der mittleren Fluoreszenzintensität grüner und roter Fluoreszenzzellen ermöglicht diese Methode die Quantifizierung von NCCR-abgeleiteter Fluoreszenz/Aktivität ohne die Verzerrung der Transfektionseffizienz und der antiproliferativen Wirkung der getesteten Wirkstoffe (z. B. Dual mTOR Inhibitoren INK128 oder PP242)5.
Eine weitere Anwendung des Reportersystems ist die Möglichkeit, die Folgen von Einfügungen, Deletionen oder Duplizierungen in der NCCR zu analysieren, die in klinischen Isolaten auf die frühe und späte promotorische Aktivität gefunden werden. In früheren Studien wurden Immunsuppressiva untersucht, um die NCCR-Aktivität zu modulieren; Es wurden jedoch keine Mutationen oder NCCR-Umlagerungen gefunden, die die Anfälligkeit beeinflussen. Mutationen können jedoch die Reaktion neuer Substanzen beeinflussen, die in naher Zukunft zugelassen werden könnten.
Dies könnte relevant sein, da im Gegensatz zu den Kodierungsregionen großes T-Antigen oder VP1-Capsid-Protein die NCCR, wie der Name schon sagt, eine nicht kodierungsregion darstellt und somit nicht dem selektiven Druck auf dem Aminosäureniveau zugrunde liegt.
In diesem Protokoll wird die Auswahl positiver Klone, die die NCCR enthalten, durch AgeI- und SpeI-Verdauung überprüft. Eine Kolonie-PCR könnte jedoch einen alternativen Ansatz darstellen, um NCCR-Einsätze direkt von E. coli, die auf Agarplatten plattiert sind, schnell abzuschirmen. Verwenden Sie für diesen Ansatz das Primerpaar BKV-CR-2-fw-AgeI und EGFP-N (Tabelle 1). Nach der Transfektion werden die Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie auf rote und grüne Fluoreszenz überprüft (Abbildung 4). Alternativ können Zellen mit 3% PFA für 20 min bei 22 °C fixiert werden. In diesem Fall mit PBS waschen, 0,2% nichtionisches Reinigungsmittel in PBS hinzufügen und 10 min inkubieren. Feste Zellen können dann mit DAPI in PBS (1 g/ml) für 10 min bei 22 °C gefärbt und einer Fluoreszenzmikroskopie-Analyse unterzogen und mit UV-Licht (340-380 nm) visualisiert werden.
Da beide Fluorophore die gleichen Polyadenylierungssignale enthalten, kann eine Wirkung der Polyadenylierungseffizienz ausgeschlossen werden. Im Vergleich zu eGFP ist tdTomato jedoch ein dimeres Protein, das entsprechend in eine längere mRNA transkribiert werden muss (Kodierungssequenz: 745 bzw. 1431 bp). Da jedoch die Aktivität der Promotoren aus den mit störenden Substanzen behandelten Zellen immer im Vergleich zu unbehandelten (DMSO) Zellen verglichen wird, spielt dieser Unterschied kaum eine Rolle. Aufgrund des Ursprungs der Replikation ermöglicht die Transfektion des Reporterplasmids in Zellen, die das SV40PyV-große T-Antigen stabil exprossieren, die Übertragung von Plasmiden auf die Tochterzellen. Es wurde gezeigt, dass das sv40 abgeleitete große T-Antigen SV40 und BKPyV NCCR und virale DNA-Replikation20transaktivieren kann. Da jedoch auch ein großes T-Antigen am Übergang von der frühen zur späten Infektionsphase beteiligt ist, wird eine künstliche Situation gegeben. Bei Verwendung dieses Assays muss berücksichtigt werden, dass der replikationsbegrenzendste Schritt der frühe Ausdruck ist, der zur Expression von großem T-Antigen führt. Um den gesamten Replikationszyklus abzubilden, sollten die frühen und späten mRNAs in infizierten Zellen mit qRT-PCR gemessen werden, wie an anderer Stelle beschrieben5,12.
Eine vergleichbare Methode wurde bereits von Schweizer und deutschen Gruppen verwendet, um archetypische und neu angeordnete BKPyV NCCR-abgeleitete promotorische Aktivitäten zu analysieren, wenn auch mit unabhängig geklonten Vektorsystemen5,9. Gosert und Kollegen aus Basel verwendeten eine ähnliche Methode, um die NCCR-Promotoraktivität der BKPyV- und JCPyV-Stämme9,10,11zu bestimmen. Beide Methoden verwendet eGFP für grüne Fluoreszenz; Die Basler Gruppe verwendete jedoch RFP, während im aktuellen Protokoll tdTomato für rote Fluoreszenz verwendet wurde. Der Vorteil von tdTomato gegenüber RFP ist die viel höhere Photostabilität; Das dimerische Protein wird jedoch durch eine Sequenz kodiert, die doppelt so lang ist wie RFP21. Darüber hinaus kann die Halbwertszeit der Proteine unterschiedlich sein, was zu einer ungleichen Konzentration 72 h nach der Transfektion führt. Dieses Problem kann jedoch nur relevant sein, wenn beide Fluoreszenzintensitäten direkt verglichen werden. Gosert et al. verwendeten BamHI und NotI als Restriktionssites, während im aktuellen Protokoll AgeI und SpeI die NCCR-Sequenz flankieren. Mit beiden Methoden lieferte der Referenz-DUNLOP-Stamm16 vergleichbare Fluoreszenzmuster mit starker früher, aber schwacher Spätpromotoraktivität9,10. In weiterer Übereinstimmung führten NCCR-Umlagerungen mit Einfügungen in der P-Region zu einem signifikanten Anstieg der früh- und späten Promotoraktivität im Vergleich zu wt-NCCR5,9.
Obwohl gezeigt wurde, dass das SV40 abgeleitete große T-Antigen SV40 und BKPyV abgeleitete NCCRs20transaktivieren kann, könnte es interessant sein, menschliche Zellen zu verwenden, die das große T-Antigen des BKPyV stabil ausdrücken und nicht das Prototypvirus SV40 in zukünftigen Studien. . In diesem Fall muss die Zelllinie jedoch leicht zu transfekt werden (z.B. HEK293).
Da die NCCR-Promotoren von Polyomaviren sehr ähnlich sind, kann diese Methode auch (mit kleiner Anpassung in den Primersequenzen) verwendet werden, um die Promotoraktivität und den Einfluss potenter antiviraler Wirkstoffe auf die Aktivität des JC-Polyomavirus (JCPyV) zu untersuchen. abgeleitete nicht kodierende Kontrollbereiche11. Da JCPyV der Erreger der progressiven multifokalen Leukoenzephalopathie (PML) ist, einer seltenen Erkrankung des zentralen Nervensystems, die bei Patienten mit Immundefekten, die zu einer schweren Neuropathologie führen, selten auftreten kann, besteht direkt wirkende antivirale Substanzen zur Behandlung immungeschwächter Patienten. Interessanterweise finden sich umgeordnete Anordnungen auch in JC NCCRs11. Da JCPyV einen ausgeprägten Neurotropismus ausgeprägt hat und somit große Mengen von Viren in Spirituosen gefunden werden, muss der Probenerwerb an die von Spirituosen abgeleitete DNA angepasst werden. Nachfolgende Schritte können jedoch leicht angepasst werden.
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Disclosures
Johannes Korth hat von Astellas und Novartis Zuschüsse für Referentenhonorale und Reisekosten erhalten. Marek Widera hat Beratungshonorare von Novartis erhalten. Oliver Witzke erhielt Stipendien für klinische Studien, Referentenhonorar, Honoraria und Reisekosten von Amgen, Alexion, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers-Squibb, Correvio, Chiesi, Gilead, Hexal, Janssen, Dr. Köhler Chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi und TEVA.
Acknowledgments
Die Autoren danken Barbara Bleekmann für die hervorragende technische Unterstützung. Unterstützt wurden diese Studien durch das IFORES-Programm der Medizinischen Hochschule Duisburg-Essen und das RIMUR-Programm der Universitätsallianz Ruhr und das Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Die Autoren danken der Jürgen-Manchot-Stiftung für das Promotionsstipendium von Helene Sertznig und die ständige Unterstützung. Die Sammlung und Verwendung von Patientenmaterial wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Duisburg-Essen (14-6028-BO) genehmigt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
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