Summary
Dans ce manuscrit, un protocole est présenté pour effectuer la mesure FACS-basée de bk-polyomavirus activité transcriptionnelle en utilisant des cellules HEK293T transfecté avec un plasmide journaliste bidirectionnel exprimant tdTomato et eGFP. Cette méthode permet en outre de déterminer quantitativement l'influence de nouveaux composés sur la transcription virale.
Abstract
Les polyomavirus, comme le BK-polyomavirus (BKPyV), peuvent causer des pathologies graves chez les patients immunodéprimés. Cependant, comme les antiviraux très efficaces ne sont pas disponibles à l'heure actuelle, des méthodes mesurant l'impact des agents antiviraux potentiels sont nécessaires. Ici, un journaliste à double fluorescence qui permet l'analyse de la région témoin non codante BKPyV (NCCR) conduite tôt et tardivement par l'activité de promoteur a été construit pour quantifier l'impact des médicaments antiviraux potentiels sur l'expression des gènes viraux par l'intermédiaire de tdTomato et eGFP expression. En outre, en clonant des amplicons de BKPyV-NCCR qui dans ce protocole ont été exemplarily obtenus à partir de l'ADN blood-dérivé des patients transplantés rénaux immunocompromis, l'impact des NCCR-réarrangements sur l'expression virale de gène peut être déterminé. Après clonage des amplicons dérivés de patient, les cellules de HEK293T ont été transfected avec les reporter-plasmides, et traitées avec des agents antiviraux potentiels. Par la suite, des cellules ont été soumises à l'analyse FACS pour mesurer les intensités moyennes de fluorescence 72 h après la transfection. Pour tester également l'analyse des médicaments qui ont un effet inhibiteur du cycle cellulaire potentiel, seules les cellules transfectées et donc fluorescentes sont utilisées. Puisque cet analyse est effectué dans de grandes cellules exprimant estomnons de T Antigène, l'impact de l'expression tôt et tard peut être analysé d'une manière mutuellement indépendante.
Introduction
Les polyométavirus représentent une famille indépendante de petits virus de l'ADN à double brin (ADN) avec le virus Simian 40 (SV40) comme espèce prototype. L'infection primaire se produit principalement pendant l'enfance, qui procèdent habituellement sans symptômes de maladie et causent habituellement des infections latentes dans les hôtes immunisés compétents. Le BK-polyomavirus (BKPyV) persiste principalement dans les cellules rénales de tubules sans causer des nephropathologies, cependant, en cas de affaiblissement de la immuno-compétence après transplantation rénale le virus peut réactiver et causer des dommages graves et la greffe altérée fonction lors de l'atteinte d'une virémie élevée (1 x 104 copies d'ADN BKPyV/mL)1,2. Chez environ 10 % des receveurs de greffe sinain, la réactivation du BK-polyomavirus (BKPyV) entraîne une néphropathie associée au polyomavirus (PyVAN), qui était jusqu'à 80 % associée à un risque élevé d'échecs d'allogreffe rénale3,4 . Comme aucun antiviral approuvé n'est disponible, le traitement actuel est basé sur la réduction de l'immunosuppression. Fait intéressant, les inhibiteurs de mTOR semblent avoir un effet antiviral ; ainsi, le passage de la thérapie immunosuppressive à l'immunosuppression mTOR-basée pourrait représenter une approche alternative pour empêcher la progression de la virémie de BKPyV5,6,7. Cependant, le mécanisme antiviral à base de mTOR est actuellement encore incomplet. Ainsi, des méthodes mesurant l'impact d'agents antiviraux potentiels dans des concentrations cliniquement pertinentes sont nécessaires.
Le génome circulaire du BKPyV se compose d'environ 5 kb abritant une région de contrôle non codante (NCCR) qui sert d'origine de la réplication et, en même temps, un promoteur bidirectionnel conduisant à l'expression des transcriptions de l'ARNm de phase précoce et tardive. Puisque les réarrangements, les suppressions et les duplications spontanément se produisant NCCR se trouvent dans LE BKPyV8 pathogène et significativement accumulés dans les patients souffrant de PVAN5,9, une comparaison de l'archétype (wt) et les activités du NCCR réarrangées (rr) sont utiles pour caractériser la condition physique répliquif virale.
Comme résumé à la figure 1, ce protocole décrit une méthode couramment utilisée pour mesurer l'activité transcriptionnelle DU RNC DE BKPyV en quantifiant la fluorescence de deux fluorophores tdTomato et eGFP exprimées à partir d'un plasmide de journaliste5, 9,10,11. La procédure est effectuée en présence de l'antigène T sV40 grand (lTAg), qui permet d'analyser l'impact des agents antiviraux potentiels sur le début et la fin NCCR-activité séparément5. Cet analyse analyse davantage l'impact des réarrangements sur l'activité du NCCR et la comparaison avec les Wt-NCCRs5,9. Le plasmide de journaliste héberge le signal de polyadenylation en retard de SV40 en aval de chaque cadre de lecture ouvert de fluorophore pour assurer le traitement comparable et efficace des deux transcriptions pour tdTomato et eGFP, respectivement. Comparé e aux méthodes qRT-PCR5,12, cette approche basée sur le FACS représente une alternative compatible à faible coût et à haut débit puisqu'aucun protocole d'extraction compliqué pour la culture cellulaire infectée et aucun coût des anticorps pour la coloration de fluorescence immunisée sont nécessaires. En outre, puisqu'une quantité définie de cellules fluorescentes sont analysées par cytométrie de flux, l'analyse des agents inhibiteurs du cycle cellulaire est également possible d'une manière quantitative.
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Protocol
Ce protocole suit les lignes directrices de la recherche humaine approuvées par le comité éthique de la faculté de médecine de l'Université de Duisburg-Essen (14-6028-BO).
1. Collecte d'échantillons de sang ou d'urine et isolement de l'ADN du polyomavirus
- Recueillir au moins 3 ml de sang dans les tubes EDTA ou l'urine dans les tubes d'acquisition.
- Centrifuger l'échantillon à 2 500 x g pendant 15 min. Au besoin, pipette plasma dans un nouveau tube et stocker les échantillons de plasma à 4 oC pendant plusieurs jours ou congeler à -20 oC pour un stockage plus long.
- Préparer 40 l de protéinase K dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml et ajouter 400 l de plasma par pipetting.
- Lyse l'échantillon en ajoutant 400 ll de tampon de lyse, vortex pour 15 s, et incuber pendant 10 min à 56 oC.
- Isolez l'ADN à l'aide d'une trousse d'extraction de sang d'ADN décrite dans les instructions du fabricant. En bref, ajouter de l'alcool et charger les lysates sur une colonne de spin contenant une membrane à base de silice liant l'ADN. Laver les colonnes plusieurs fois pour produire de l'ADN pur.
- Éluter l'ADN produit dans 30-50 L de tampon TE.
2. Amplification de la région de contrôle non codante (NCCR)
- Effectuez la procédure suivante dans des pièces physiquement séparées. Utilisez une pièce isolée pour préparer les réactifs et distribuer le mélange aux tubes PCR.
- Préparer le Master Mix pour le pré-PCR à l'aide de la paire amorce A (tableau 1) dans un volume total de 50 L et utiliser l'ADN précédemment isolé de l'étape 1.6. Le schéma de pipetage pour la préparation du mix maître pour le PCR pré et imparable est imprimé dans le tableau 2.
- Distribuer 45 L du mélange maître dans les tubes PCR.
- Ajouter 5 L de l'ADN isolé dans les tubes PCR.
REMARQUE : Utilisez une autre pièce que celle pour la préparation du mélange principal afin d'éviter la contamination. - Exécuter le PCR avec les conditions de réaction comme illustré dans le tableau 3. Répéter la dénaturation, l'annexion et l'extension en 35 cycles.
- Pour l'amplification imisée utiliser la paire d'apprêt B hébergeant les sites de restriction pour AgeI et SpeI (tableau 1).
- Exécuter le PCR inodu avec les conditions de réaction décrites dans les étapes 2.2 à 2.5 en utilisant 5 'L du pré-PCR.
- Mélanger 10 L du produit PCR avec 2 l l de colorant de chargement de gel 6x. Chargez 10 l l du mélange sur un gel d'agarose de 1,5 % et faites fonctionner le gel pendant 30 min à 60 mA.
- Visualisez le gel à l'aide d'un système de documentation UV approprié.
REMARQUE : On s'attend à ce que la taille de l'amplicon se situe entre 300 et 500 pb selon qu'il y a eu des réarrangements (suppressions, insertions ou duplications) (figure2C). - Purifez les amplicons PCR à l'aide d'un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Elute les amplicons PCR en 30 L de tampon d'élution.
- Envoyer les amplicons pour le séquençage Sanger à l'aide de la paire d'amorce B.
3. Clonage du NCCR dans le journaliste à double fluorescence
- Diglesles purifiés amplicons (étape 2.10) avec AgeI et SpeI pendant 2 h à 37 oC comme décrit dans le tableau 4.
- Répétez l'étape 2.10 et purifiez les amplicons digérés.
- En parallèle, digérez également l'épine dorsale plasmique (1,5 g) avec AgeI et SpeI pendant 2 h à 37 oC, tel que décrit dans le tableau 5. Cette étape n'a besoin d'être effectuée qu'une seule fois. Pour les réactions ultérieures, congeler la digestion à -20 oC.
- Analyser l'épine dorsale plasmique digérée sur un gel agarose à faible fonte de 0,8 %.
REMARQUE: Ne pas exécuter le gel avec un courant supérieur à 40 mA. L'encart attendu de la région de l'espaceur à l'origine dérivé du plasmien pEX-K4 2-LTR CD313 est de 128 pb (figure 2C). - Visualisez les fragments d'ADN à l'aide de la lumière UV à ondes longues (320 nm) et découpez la bande dorsale à l'aide d'un scalpel propre. Transférer le fragment de gel à faible fusion dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 ml. Évitez les longs temps d'exposition aux UV pour prévenir les dommages à l'ADN.
REMARQUE : Étant donné que l'agarose à faible fonte est utilisée, il n'est pas nécessaire de purifier l'ADN avant la ligature. - Chauffer l'épine dorsale contenant la pièce d'agarose à faible fonte pendant 10 min à 65 oC afin de faire fondre le morceau de gel et mélanger toutes les 2 min par un vortex doux. Le gel fondu peut être directement utilisé pour la ligature.
- Ligate l'épine dorsale et l'amplicon digéré en utilisant t4 d'ADN ligase pendant la nuit à 16 oC en utilisant le schéma montré dans le tableau 6.
- Effectuer la transformation de E. coli en utilisant la méthode de choc thermique, les bactéries de plaque sur les plaques LB-ampères, et la culture à 37 oC pendant la nuit.
- Le lendemain, sélectionnez trois clones positifs et préparez la culture E. coli (5 ml de LB-Amp) et la culture à 37 oC.
- Isolez le plasmide-ADN à l'aide de protocoles standard tels que décrits ailleurs14, effectuer la digestion AgeI et SpeI pour vérifier les clones positifs et visualiser les fragments découpés sur un gel agarose 1%. La bande de l'espaceur (128 pb) sera remplacée par la plus grande séquence DuCR (300-500 pb, voir ci-dessus).
- Envoyer le plasmide pour le séquençage Sanger à l'aide de l'amorce EGFP-N ou de la paire d'amorce B (tableau 1).
- Puisque les mutations pourraient se produire spontanément, comparez les résultats de séquençage avec les résultats de séquençage obtenus avec l'amplicon. N'utilisez que les clones contenant des séquences identiques par rapport à l'amplicon.
- Utiliser un logiciel d'établi moléculaire (p. ex., freeware GENtle 1.9.4 ou d'autres programmes d'édition de séquences) pour aligner et modifier les séquences obtenues (figure 3).
- Démarrez GENtle 1.9.4 et importez les séquences d'ADN en cliquant sur le bouton Import (flèche vers le bas verte).
- Cliquez ensuite sur L'outil et sélectionnez L'alignement du menu (Utilisez Ctrl-G comme raccourci) et choisissez les séquences d'ADN pour l'alignement.
- Ajoutez une séquence à l'alignement en cliquant sur Ajouter ou supprimer une séquence en cliquant sur Supprimer. Inclure une séquence de consensus NCCR archétypale comme JN19243815, n'utilisez pas la séquence NCCR de la souche Dunlop couramment utilisée16, car il abrite des réarrangements et duplications autres que l'archétype BKPyV Souches.
REMARQUE : Le NCCR contient déjà le codon de démarrage translationnel (figure 3). - Choisissez une méthode pour l'alignement en cliquant sur algorithme dans la barre d'outils et choisissez clustal W. Définir les paramètres d'alignement pour correspondre à 2; pénalité d'extension de l'écart -1; pénalité d'écart -2 et cliquez sur OK pour exécuter l'alignement.
4. Transfection transitoire des cellules HEK293T avec le plasmide du journaliste et traitement avec des agents antiviraux potentiels
- Pour préparer des quantités suffisantes d'ADN plasmide pour les expériences de transfection ultérieures préparer une culture de 150 ml pendant la nuit. Isolez l'ADN plasmide à l'aide d'un kit d'isolement plasmide. Alternativement, d'autres kits de purification plasmique peuvent être utilisés.
- Graines 1 x 105 cellules HEK293T dans le DMEM contenant 10 % de FCS, de pénicilline et de streptomycine (1x) par puits d'une plaque de 12 puits 24 h avant la transfection et incuber pendant la nuit à 37 oC et 5 % de CO2 pour maintenir la prolifération active pendant la transfection.
REMARQUE : Les cellules doivent être environ 80 % de confluents lors de la transfection. - Placer 250 l de milieux sériques réduits dans un tube stérile et ajouter 1 g d'ADN plasmide de chaque journaliste et mélanger délicatement par pipetting.
- Ajouter 3 ll du réactif transfection au mélange d'ADN, mélanger délicatement par pipetting et incuber pendant 15 min. Préchauffer le réactif transfection à la température ambiante de 22 oC et le vortex doucement avant utilisation.
- Ajouter le mélange goutte-sage pour les puits et distribuer délicatement au puits.
- Après 4 h, remplacer le supernatant par un milieu frais contenant les agents d'essai et le contrôle des solvants. Incuber à 37 oC jusqu'à l'analyse. Dans cet exemple, les inhibiteurs de mTOR INK128 (100 ng/mL) et la rapamycine (100 ng/mL) ont été utilisés.
5. Microscopie de fluorescence et cytométrie de flux
- Vérifier la présence de la fluorescence rouge et verte chez les cellules rouges et vertes sous le microscope à fluorescence (figure 4).
REMARQUE : La fluorescence rouge et verte correspond à l'expression précoce et tardive du gène BKPyV, respectivement. - Après 72 h après la transfection, aspirez le supernatant et lavez les cellules deux fois avec 1 ml de PBS froid.
- Ajouter délicatement 500 l de trypsine et tourner légèrement la plaque pour éviter le détachement prématuré des cellules. Cette étape est importante pour éviter les doublets cellulaires.
- Après plus, retirez la trypsine directement avec la même pointe de pipette.
- Incuber les cellules pendant au moins 5 min à 37 oC.
- Resuspendre les cellules trypsinisées avec 1 ml de PBS contenant 3% de FCS et transférer la suspension dans des tubes FACS pré-étiquetés.
- Ajouter le DAPI (1 g/mL) avant l'analyse FACS.
- Analyser les cellules à l'aide d'un cytomètre de débit. Pour chaque échantillon, mesurez au moins 10 000 cellules vivantes, qui sont négatives pour la coloration DAPI.
6. Analyse des données
- Importer les données au logiciel d'analyse de cytométrie de flux et ajouter des échantillons par Click and Drag dans l'espace de travail.
- Double cliquez sur le fichier importé et créez une parcelle graphique. Choisissez FSC-A contre SSC-A en cliquant sur l'axe x et y. Portez la population cellulaire principale en cliquant sur Polygone à la barre d'outils et en encadrant la population cellulaire (figure 5). Nommez la population cellulaire choisie au besoin (par exemple les « cellules uniques »). Les «cellules uniques» apparaîtront comme un nouvel espace de travail.
- Procédez avec le gating "cellules uniques" pour DAPI négatif (c.-à-d., "cellules vivantes"). Pour identifier les cellules vivantes comparer la population cellulaire avec et sans coloration DAPI. Dans les deux parcelles, choisissez FSC-A contre pacific-blue-A.
- Cliquez sur le rectangle et choisissez la population de cellules négatives DAPI, nommez la population cellulaire choisie « cellules vivantes », et créez une nouvelle parcelle de points montrant FITC (eGFP) contre PE (tdTomato) comme décrit précédemment.
- Ajouter des quadrants dans les « cellules vivantes » en choisissant Quad à partir de la barre d'outils. Portez la population en faisant glisser le centre du quadrant au bord de chaque population. Les quadrants représentent 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOMMD, 3) eGFP-tdTOM-, 4) eGFP-tdTOMMD.
REMARQUE : En raison de la pari spectrale des spectres d'émission entre le FITC et le PE, la compensation initiale est essentielle pour distinguer les signaux rouges et verts et obtenir des résultats précis. - Déterminer les intensités moyennes de fluorescence (IMF) en cliquant à droite sur le quadrant et en choisissant Add Statistics. Choisissez Moyen et cliquez sur OK. L'IMF moyenne est maintenant affichée en dessous de la population dans la section «statistiques». Les quadrants 2 et 4 correspondent à l'expression précoce, tandis que les quadrants 3 et 4 représentent l'expression tardive.
- Ajoutez des répliques supplémentaires de la même manière pour la puissance statistique.
- Pour l'interprétation des données, tracer les valeurs de l'IMF du début et de la fin dans une parcelle de barre :
- Pour comparer les activités du CnrC obtenues à partir de différents donneurs ou souches virales, ajoutez un contrôle archétypale ou la souche Dunlop16 et fixez ses IMF relatives à 100 % et calculez les valeurs relatives de l'IMF. Répétez avec chaque réplique et déterminez l'écart entre la moyenne et la norme.
- Pour évaluer l'effet des composés potentiels sur l'activité transcriptionnelle, fixez le contrôle du solvant à 100 % et tracez l'IMF des cellules traitées.
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Representative Results
Dans cette expérience représentative, l'activité transcriptionnelle pilotée par la région de contrôle non codant de BK-polyomavirus a été mesurée par cytométrie de flux. En outre, un inhibiteur de mTOR, qui pourrait être employé pour traiter des patients après la réactivation de BKPyV, a été examiné pour son inhibition de l'expression tôt virale de gène. À cette fin, un double dis-t-il de fluorescence-reporter a été employé comme édité précédemment5. Le schéma global de workflow de la configuration expérimentale est illustré dans Figure 1. Tout d'abord, des échantillons de sang provenant de patients transplantés rénaux immunodéprimés ont été prélevés selon les lignes directrices de la recherche humaine approuvées par le comité d'éthique institutionnel. Le sang a été recueilli dans des tubes contenant de l'EDTA et les phases ont été séparées par centrifugation. Par la suite, 400 L de plasma ont été utilisés pour l'isolement de l'ADN du polyomavirus. La région de contrôle non codante (NCCR) a été amplifiée à l'aide d'un protocole PCR immunisé tel qu'illustré dans la figure 2A à l'aide de la paire d'amorce externe BKV-CR-1fw et BKV-CR-1rv, ainsi que de la paire d'amorces intérieures BKV-CR-2fw-AgeI (Primer AgeI) et BKV-CR-2rv-SpeI ( Primer SpeI)17, ce dernier qui abrite les sites de restriction pour AgeI et SpeI. La vérification de l'amplicon a été effectuée par électrophoresis de gel d'agarose comme indiqué dans la figure 2B. Tandis que les amplicons dérivés des séquences archétypales de NCCR (wt) ont eu une distribution homogène de taille dans le gel, ceux dérivés des NCDR réarrangés avec des insertions (rrins) et des suppressions (rrdel)ont différé dans leur taille (environ 300-500 bp). Notamment, en raison de réarrangements, la séquence de référence16 (DUN) de Dunlop, qui a été incluse comme contrôle, était plus grande que la NCCR obtenue à partir de virus archétypaux. Étant donné que les amplicons correspondaient aux tailles prévues, les produits PCR purifiés ont été envoyés pour le séquençage de Sanger pour une comparaison ultérieure avec les séquences clonées dans le plasmide du journaliste pour une analyse plus approfondie.
Pour le clonage des amplicons, la digestion a été exécutée utilisant les deux enzymes de restriction AgeI et SpeI. Après le clonage dans le journaliste de fluorescence double, qui a été effectué en utilisant la procédure standard de clonage, la sélection des clones positifs contenant le NCCR a été vérifiée par la digestion AgeI et SpeI (Figure 2C). Ici, la petite région de l'espaceur (NC, 128 pb) a été remplacée par les plus gros fragments de NCCR (environ 300-500 pb) indiquant des clones positifs. L'ADN de Plasmid isolé des clones vérifiés a été envoyé pour le séquençage de Sanger et comparé aux séquences obtenues du séquençage d'amplicon (non montré). Seuls les clones qui correspondent à la séquence d'amplicon ont été choisis pour un traitement ultérieur. Comme le montre la figure 3, les résultats du séquençage ont été comparés à une séquence archétypale du NCCR (JN192438). Dans cet exemple, une suppression dans le bloc P et une substitution dans le bloc O ont été détectées.
Pour tester par la suite l'activité transcriptionnelle des séquences de NCCR clonées dans la culture cellulaire, les cellules HEK293T ont été transfectées transitoirement avec les constructions respectives du journaliste (figure 4A). Tel qu'il est visualisé à la figure 4B,l'efficacité de la transfection et l'activité du NCCR ont été surveillées par microscopie à fluorescence. La fluorescence rouge et verte correspondait à l'expression précoce et tardive du gène BKPyV, respectivement5. Les cellules ont exprimé les deux fluorophores indiquant l'activité promotrice tôt et la fin efficace. Comme l'illustrent les deux exemples, le premier NCCR (NCCR1) a montré une forte expression génique tardive, tandis que le deuxième exemple (NCCR2) avait une expression génétique tardive précoce mais modérée relativement forte (figure4B). Ainsi, des échantillons ont été préparés pour la mesure de cytométrie de flux. Comme décrit dans la section 6 du protocole, les cellules négatives DAPI ont été fermées (figure5A, panneau inférieur) et une parcelle de point a été créée montrant eGFP contre tdTomato. Les échantillons qui étaient négatifs (figure 5B), ainsi que ceux positifs pour tdTomato (figure 5C) ou eGFP (figure 5D) seulement, ont été inclus dans l'analyse. Notez, la compensation initiale a été effectuée, ce qui est essentiel pour distinguer les signaux rouges et verts et pour obtenir des résultats précis18. Des intensités moyennes de fluorescence ont été dérivées de chaque clone d'essai. Ici, les cellules positives de tdTomato ont correspondi à l'expression tôt tandis que les cellules positives d'eGFP ont représenté l'expression en retard. Dans cet exemple, le traitement avec le double inhibiteur de mTOR INK128 a considérablement réduit l'IMF tdTomato (Figure 5E-F), ce qui signifie que l'expression précoce a été inhibée.
Figure 1 : Schéma de workflow pour la configuration expérimentale. 1) Collecte d'échantillons de sang (alternativement urine), 2) Isolement de l'ADN de polyomavirus 3) Amplification de la région de contrôle non codante (NCCR) utilisant un protocole de PCR immincé, 4) électrophorèse et amplicon de gel d'Agarose vérification, 5) Séquençage de sanger de l'amplicon PCR, 6) Clonage du NCCR dans le journaliste à double fluorescence à l'aide d'AgeI et SpeI, 7) Sélection de clones positifs, 8) Squencing Sanger de l'ADN plasmide, 9) Transfection transitoire des cellules HEK293T avec le plasmide du journaliste et ajout de composés à tester, 10) microscopie à fluorescence pour vérifier la transfection efficace, 11) Analyse de cytométrie de flux, 12) Gating et analyse de l'expression eGFP tdTomato, 13) Interprétation des données. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : PCR niché et analyse représentative des NCCR-amplicons dérivés de patient. A) L'ADN dérivé des patients transplantés rénaux immunocompromis a été soumis à l'amplification semi-imparée de PCR utilisant des amorces d'oligonucleotide liées aux emplacements de restriction AgeI et SpeI. Les noms d'amorce et la longueur (paires de base) des blocs O, P, Q, R et S archétypes de la souche BKPyV JN192438 sont indiqués entre parenthèses. B) Les amplicons ont été analysés par électrophoresis dans le gel d'agarose de 1.5% et visualisés utilisant la coloration d'ADN. Échelle deM 1 à 100 pb, wt et wildtype (archétype), rr et réarrangé, insertions, suppressions de l'un, DUN et Dunlop Strain. C) Digestion plasmide avec AgeI et SpeI. Des fragments digérés ont été analysés par électrophorèse dans le gel d'agarose de 1,5% et visualisés utilisant la coloration d'ADN. Échelle m1 à 100 p. 100, échelle m2 et 2 billes. NC - contrôle négatif (espaceur). Clone positif. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Clonage et validation du NCCR dans le journaliste à double fluorescence. Résultats représentatifs du séquençage plasmide. Les amplicons ont été purifiés à l'aide d'un kit de purification PCR et soumis au séquençage de Sanger. Les séquences respectives ont été alignées à la séquence de NCCR dérivée de la souche archétype de BKPyV JN192438. Les suppressions et les substitutions sont marquées en rouge. Les sites de restriction AgeI et SpeI, le début translationnel du cadre de lecture ouverte eGFP (imprimé en gras) ainsi que les blocs NCCR O-S sont indiqués. Les blocs respectifs et les sites de restriction sont mis en évidence en couleur. La longueur de chaque bloc NCCR en paires de base est imprimée entre parenthèses. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Analyse de microscopie de fluorescence représentative de l'activité précoce et tardive de promoteur de NCCR. A) Carte génétique du journaliste à double fluorescence sous le contrôle du promoteur bidirectionnel. Comme décrit précédemment5 le plasmid pTA-tdTOM-NCCR-eGFP (6 009 pb) abrite le signal de polyadenylation tardive SV40 en aval de chaque cassette d'expression afin d'assurer un traitement comparable et efficace des deux transcriptions pour tdTomato (début eGFP (expression tardive), respectivement. Le NCCR est flanqué d'AgeI et de SpeI. Le vecteur contient une cassette de résistance à l'ampicilline pour la sélection pendant la procédure de clonage. B) Les cellules HEK293T ont été transfectées avec des constructions de journaliste de double fluorescence chacune sous le contrôle des séquences de NCCR dérivées de patient (NCCR1-2). Des cellules ont été soumises à l'analyse de microscopie de brightfield et de fluorescence 72 h après la transfection. Les réglages de filtre du microscope ont été utilisés dans les gammes d'excitation suivantes : vert pour tdTomato (515-560 nm) et bleu pour eGFP (450-490 nm). La barre d'échelle (200 m) est indiquée en bas à droite de chaque photographie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Analyse FACS représentative. La stratégie de gating simple requise pour cette méthode est montrée. Des parcelles de densité ou de points à deux paramètres sont utilisées. A) Tout d'abord, FSC est tracé contre Pacific Blue, tandis que seuls les DAPI négatifs (c.-à-d., les cellules vivantes) sont traités davantage. B-F) FITC (eGFP) versus PE (tdTomato) sont tracés. C-D) Ajoutez exclusivement des cellules fluorescentes vertes et rouges pour ajuster la compensation sur le cytomètre de débit. E-F) Dans cet exemple, les inhibiteurs de mTOR INK128 et réduit considérablement l'IMF tdTomato, qui correspond à une réduction de l'expression précoce du gène BKPyV. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Nom d'amorce | Séquence (5' à 3') |
| BK-CR-fwd1 (en) | CCCAGGCAGCTTTCAAGGC |
| BK-CR-rev1 | CCTCTACaAAATTCCAGCAAAAAGC |
| BKV-CR-2-fw-AgeI | AAAAAAACCGGTTTTTGCAAAAATTGCAAAAGAATAGG |
| BKV-CR-2-rv-SpeI | TTTTTT TACTCTGCCGCAGAACCATAGATGGCCTTT TTTTTTTACTAGTCTGGCGCAGAACCATAGAGAG |
| EGFP-N | CGTCGTCGTCGTGCTCGACCAG |
Tableau 1 : Oligonucleotides utilisés dans ce protocole. Les bases soulignées indiquent les sites d'enzymes de restriction pour AgeI et SpeI, respectivement.
| composant | Volume/réaction (l) | concentration finale |
| Eau sans RNase | 32,8 l | - |
| 10x PCR Buffer | 5 ll | 1x 1x |
| dNTPs (10 mM de chaque) | 1 l | 0,2 mM de chaque dNTP |
| Fwd-primer (10 m) | 3 l | 0,3 M |
| Rev-primer (10 m) | 3 l | 0,3 M |
| Polymériase Taq | 0,2 l | 2 unité/réaction |
| Adn de modèle | 5 ll | Réaction de lt;0,5 g/50 L |
Tableau 2 : Protocole de préparation de mélange principal. L'instruction s'applique aux réactions de PCR pré- et inodues telles que décrites dans les étapes 2.2 et 2.7, respectivement.
| température | durée | PCR-étape | Cycles |
| 95oC | 5 min | Dénaturation initiale | |
| 95oC | 30 sec | Dénaturation | |
| 55oC | 34 sec | Recuit | x35 (en) |
| 72oC | 1 min | prolongation | |
| 72oC | 10 min | Prolongation finale | |
| 4oC | ∞ | rafraîchissant |
Tableau 3 : Programme PCR utilisé pour l'amplification du NCCR. L'instruction s'applique aux réactions PCR pré- et inodues.
| réactif | Volume/réaction (l) | concentration finale |
| DNase-libre H20 | 6 Annonces | à 20 l |
| 10x Tampon | 2 (en) | 1x 1x |
| AgeI AgeI | 1 Fois | 10 unités |
| SpeI (SpeI) | 1 Fois | 10 unités |
| purifié PCR-amplicon | 10 Ans et plus | variable |
Tableau 4 : Protocole de digestion d'Amplicon. L'instruction s'applique à la digestion simultanée de l'ADN d'amplicon avec deux enzymes de restriction décrites à l'étape 3.1.
| réactif | Volume/réaction (l) | concentration finale |
| DNase-libre H20 | 14,5 annonces | à 20 l |
| 10x Tampon | 2 (en) | 1x 1x |
| AgeI AgeI | 1 Fois | 10 unités |
| SpeI (SpeI) | 1 Fois | 10 unités |
| Épine dorsale de Plasmid (1 g/L) | 1,5 | 1,5 g |
Tableau 5 : Protocole de digestion plasmide. L'instruction s'applique pour la digestion simultanée de l'épine dorsale de l'ADN plasmide avec deux enzymes de restriction décrites à l'étape 3.3.
| réactif | Volume/réaction (l) | concentration finale |
| DNase-libre H20 | 7 Annonces | à 20 l |
| Ligase d'ADN T4 | 1 Fois | 20 Ans, états-unis |
| 10x tampon de ligase d'ADN T4 | 2 (en) | 1x 1x |
| Épine dorsale purifiée de Plasmid Faible fonte diluée 1/2 de l'étape 3.5 |
2 (en) | variable |
| PCR-amplicon digéré et purifié de l'étape 2.7 | 8 Annonces | variable |
Tableau 6 : Protocole de ligature Plasmi. L'instruction s'applique à la ligature de l'épine dorsale de l'ADN plasmide avec l'ADN digéré d'amplicon de PCR décrit à l'étape 3.7.
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Discussion
Dans cet article, une méthode couramment utilisée est présentée qui permet l'analyse de la BKPyV non-codage de contrôle-région (NCCR) conduit début et tard l'activité du promoteur. L'activité du NCCR peut être mesurée simultanément et n'a pas besoin de lyse des cellules transfectées. En outre, un nombre relativement important de cellules peut être analysée et la co-transfection de marqueurs supplémentaires pour la normalisation des valeurs de fluorescence n'est pas nécessaire.
Une partie critique de cette méthode est que le NCCR cloné devrait contenir exactement les mêmes séquences que identifiées par le séquençage d'amplicon, qui correspond aux variantes majoritaires présentes dans le plasma patient. Pour obtenir des résultats précis et pour minimiser les erreurs sujettes aux PCR, il est fortement recommandé d'utiliser une polymérase avec une activité de lecture de preuve. Alternativement, les séquences peuvent être commandées par des services commerciaux de synthèse de gènes. Les séquences désignées du NCCR peuvent être commandées, y compris les sites de restriction AgeI et SpeI pour le clonage direct. Dans ce cas, digérez le plasmide parallèle au plasmide de l'épine dorsale et remplacez l'insert de l'espaceur par le fragment de NCCR correspondant de la construction synthétisée. L'ADN peut être isolé alternativement à partir d'échantillons d'urine. Cependant, puisque BKPyV est également sécrété dans l'urine par des individus immunocompétents et ne reflètent pas nécessairement la réplication active, la pertinence clinique est limitée. Idéalement, l'ADN peut également être isolé à partir de biopsies rénales dans lesquelles auparavant PVAN pourrait être histologiquement détecté (comparer avec Korth et al., 201919).
En mesurant l'intensité moyenne de fluorescence des cellules fluorescentes vertes et rouges, cette méthode permet de quantifier la fluorescence/activité dérivée du RCNR sans le biais de l'efficacité de la transfection et des effets antiproliférens des agents testés (p. ex., double mTOR inhibiteurs INK128 ou PP242)5.
Une autre application du système de journaliste est la possibilité d'analyser les conséquences des insertions, des suppressions, ou des duplications dans le NCCR trouvés dans les isolats cliniques sur l'activité promotrice tôt et en retard. Dans des études précédentes, des agents immunosuppresseurs ont été étudiés pour moduler l'activité de NCCR ; cependant, aucune mutation ou réarrangements de NCCR n'ont été trouvés qui affectent la susceptibilité. Cependant, les mutations peuvent affecter la réponse de nouvelles substances qui pourraient être approuvées dans un proche avenir.
Cela pourrait être pertinent car contrairement aux régions codantes grande protéine t antigène ou VP1 capside, le NCCR comme son nom l'indique représente une région non codante et ne sous-tend donc pas la pression sélective au niveau des acides aminés.
Dans ce protocole, la sélection des clones positifs contenant le NCCR est vérifiée par la digestion AgeI et SpeI. Cependant, une colonie PCR pourrait représenter une approche alternative pour dépister rapidement les inserts de NCCR directement à partir d'E. coli plaqués sur des plaques d'agar. Pour cette approche, utilisez la paire d'amorce BKV-CR-2-fw-AgeI et EGFP-N (tableau 1). Après la transfection, les cellules sont vérifiées pour la fluorescence rouge et verte à l'aide de la microscopie à fluorescence (figure 4). Alternativement, les cellules peuvent être fixées en utilisant 3% DE PFA pendant 20 min à 22 oC. Dans ce cas, laver avec du PBS, ajouter 0,2 % de détergent non ionique dans le PBS et incuber pendant 10 min. Les cellules fixes peuvent ensuite être tachées de DAPI en PBS (1 g/mL) pendant 10 min à 22 oC et soumises à une analyse de microscopie à fluorescence et visualisées à l'aide de lumière UV (340-380 nm).
Puisque les deux fluorophores abritent les mêmes signaux de polyadenylation, un effet de l'efficacité de polyadenylation peut être écarté. Cependant, par rapport à eGFP, tdTomato est une protéine dimérique qui doit être transcrite en conséquence en un ARNm plus long (séquence de codage: 745 contre 1431 bp, respectivement). Cependant, puisque l'activité des promoteurs des cellules traitées avec des substances interférantes est toujours comparée par rapport aux cellules non traitées (DMSO), cette différence joue peu de rôle. En raison de la présence de l'origine de la réplication, la transfection du plasmide du journaliste dans les cellules exprimant de façon stable le grand antigène T SV40PyV permet le transfert des plasmides aux cellules filles. Il a été démontré que le sV40 dérivé grand antigène T peut transactiver SV40 et BKPyV NCCR et la réplication virale de l'ADN20. Cependant, puisqu'un grand antigène De T est également impliqué dans la transition de la phase tôt à la phase tardive de l'infection, une situation artificielle est donnée. En utilisant cet exemple, il faut considérer que l'étape la plus limitative de réplication est l'expression précoce menant à l'expression d'un grand antigène T. Afin de cartographier le cycle complet de réplication, les ARNm précoces et tardives doivent être mesurés dans des cellules infectées par qRT-PCR tel que décrit ailleurs5,12.
Une méthode comparable a déjà été utilisée par les groupes suisses et allemands pour analyser les activités promotrices bkPyV NCCR archétyques et réarrangées, bien qu'avec des systèmes vectoriels clonés indépendamment5,9. Gosert et ses collègues bâlois ont utilisé une méthode similaire pour déterminer l'activité de promoteur du NCCR des souches BKPyV et JCPyV9,10,11. Les deux méthodes ont utilisé l'eGFP pour la fluorescence verte; cependant, le groupe bâlois a utilisé la DP alors que dans le protocole actuel tdTomato a été utilisé pour la fluorescence rouge. L'avantage de tdTomato sur La DP est la photostabilité beaucoup plus élevée; cependant, la protéine dimérique est codée par une séquence qui est deux fois plus longue que la DP21. En outre, les demi-vies des protéines pourraient être différentes, résultant en une concentration inégale 72 h après la transfection. Cependant, cette question ne peut être pertinente que si l'on compare directement les deux intensités de fluorescence. Gosert et coll. ont utilisé BamHI et NotI comme sites de restriction alors que dans le protocole actuel AgeI et SpeI sont flanqués de la séquence NCCR. En utilisant les deux méthodes, la souche dunlop de référence16 a donné des modèles comparables de fluorescence avec une forte activité de promoteur tardif précoce mais faible9,10. Dans un autre accord, les réarrangements du NCCR avec insertions dans la région P ont entraîné une augmentation significative de l'activité des promoteurs précoces et tardifs par rapport à wt-NCCR5,9.
Bien qu'il ait été démontré que le SV40 dérivé grand antigène T peut transactiver SV40 et BKPyV dérivé NCCRs20, il pourrait être intéressant d'utiliser des cellules humaines qui expriment de façon stable le grand antigène T de la BKPyV et non le virus prototype SV40 dans de futures études . Cependant, dans ce cas, la lignée cellulaire doit être facile à transfect (par exemple, HEK293).
Étant donné que les promoteurs de polyomavirus du NCCR sont très semblables, cette méthode peut également être utilisée (avec une petite adaptation dans les séquences d'amorce) pour étudier l'activité des promoteurs et l'influence d'agents antiviraux puissants sur l'activité du JC-polyomavirus (JCPyV) régions dérivées de contrôle non codant11. Puisque JCPyV est l'agent causatif de la leukoencéphalopathie multifocale progressive (PML), une maladie rare de système nerveux central qui peut rarement se produire dans les patients présentant des immunodéficiences ayant pour résultat la neuropathologie grave, il y a également un besoin pressant de trouver des substances antivirales agissantes directes pour traiter les patients immunodéprimés compromis. Fait intéressant, des réarrangements sont également trouvés dans JC NCCRs11. Étant donné que JCPyV a prononcé le neurotropisme et que de grandes quantités de virus se trouvent donc dans l'alcool, l'acquisition d'échantillons doit être ajustée à l'ADN dérivé de l'alcool. Cependant, les étapes suivantes peuvent être facilement adaptées.
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Disclosures
Johannes Korth a reçu des subventions pour les frais d'orateur et les frais de voyage d'Astellas et Novartis. Marek Widera a reçu des honoraires de conseil de Novartis. Oliver Witzke a reçu des bourses pour des études cliniques, des honoraires d'orateur, des honoraires et des frais de voyage d'Amgen, Alexion, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers-Squibb, Correvio, Chiesi, Gilead, Hexal, Janssen, Dr. Kôhler Chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi et TEVA.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Barbara Bleekmann pour son excellente assistance technique. Ces études ont été soutenues par le programme IFORES de l'École de médecine de l'Université de Duisburg-Essen et le programme RIMUR de l'Alliance universitaire Ruhr et le Centre de recherche Mercator Ruhr (MERCUR). Les auteurs remercient le Juergen-Manchot-Stiftung pour la bourse de doctorat d'Hélène Sertznig et son soutien constant. La collecte et l'utilisation du matériel patient ont été approuvées par le comité d'éthique de la faculté de médecine de l'Université du Duisburg-Essen (14-6028-BO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
References
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