Summary

Messung der BK-Polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Published: July 13, 2019
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Summary

In diesem Manuskript wird ein Protokoll zur FACS-basierten Messung der Transkriptionsaktivität des BK-Polyomavirus unter Verwendung von HEK293T-Zellen vorgestellt, die mit einem bidirektionalen Reporter-Plasmid transfiziert werden, das tdTomato und eGFP exzessiiert. Diese Methode ermöglicht es ferner, den Einfluss neuartiger Verbindungen auf die virale Transkription quantitativ zu bestimmen.

Abstract

Polyomaviren, wie das BK-Polyomavirus (BKPyV), können schwere Pathologien bei immungeschwächten Patienten verursachen. Da jedoch derzeit keine hochwirksamen antiviralen Mittel verfügbar sind, sind Methoden erforderlich, die die Wirkung potenzieller antiviraler Wirkstoffe messen. Hier wurde ein Dual-Fluoreszenz-Reporter konstruiert, der die Analyse der BKPyV-Nicht-Kodierungs-Kontrollregion (NCCR) ermöglicht, die früh und spät epromoternde Aktivität angetrieben hat, um die Auswirkungen potenzieller antiviraler Medikamente auf die virale Genexpression über tdTomato und eGFP zu quantifizieren. ausdruck. Darüber hinaus können durch das Klonen von BKPyV-NCCR-Amplonikern, die in diesem Protokoll exemplarisch aus der blutabgeleiteten DNA immungeschwächter renaltransplantierter Patienten gewonnen wurden, die Auswirkungen von NCCR-Umlagerungen auf die virale Genexpression bestimmt werden. Nach dem Klonen der vom Patienten abgeleiteten Amplika wurden HEK293T-Zellen mit den Reporter-Plasmiden transfiziert und mit potenziellen antiviralen Wirkstoffen behandelt. Anschließend wurden die Zellen einer FACS-Analyse unterzogen, um die mittleren Fluoreszenzintensitäten 72 h nach der Transfektion zu messen. Um auch die Analyse von Medikamenten zu testen, die eine potentielle zellzyklushemmende Wirkung haben, werden nur transfizierte und damit fluoreszierende Zellen verwendet. Da dieser Test in großen T-Antigen-Expressionszellen durchgeführt wird, können die Auswirkungen der frühen und späten Expression auf gegenseitig unabhängige Weise analysiert werden.

Introduction

Polyomaviren stellen eine unabhängige Familie kleiner doppelsträngiger DNA-Viren (dsDNA) dar, wobei das Simian-Virus 40 (SV40) als Prototypart existiert. Die primäre Infektion tritt vor allem während der Kindheit, die in der Regel ohne Krankheitssymptome und in der Regel latente Infektionen bei immunkompetenten Wirten verursachen. Das BK-Polyomavirus (BKPyV) bleibt hauptsächlich in Nierentubulizellen ohne Nephropathologien fort, kann jedoch im Falle einer Beeinträchtigung der Immunkompetenz nach einer Nierentransplantation reaktivieren und schwere Schäden und beeinträchtigte Transplantate verursachen. bei Erreichen einer hohen Virämie (1 x 104 BKPyV DNA-Kopien/ml)1,2. Bei etwa 10% der Nierentransplantationsempfänger führt die Reaktivierung des BK-Polyomavirus (BKPyV) zu einer Polyomavirus-assoziierten Nephropathie (PyVAN), die mit einem hohen Risiko für Renal-Allograft-Ausfällen verbunden war3,4 . Da keine zugelassenen antiviralen Wirkstoffe verfügbar sind, basiert die aktuelle Therapie auf der Reduktion der Immunsuppression. Interessanterweise scheinen mTOR-Hemmer eine antivirale Wirkung zu haben; Daher könnte die Umstellung der immunsuppressiven Therapie auf mTOR-basierte Immunsuppression einen alternativen Ansatz darstellen, um das Fortschreiten der BKPyV-Virämie5,6,7zu verhindern. Der mTOR-basierte antivirale Mechanismus ist derzeit jedoch noch nicht vollständig verstanden. Daher sind Methoden zur Messung der Wirkung potenzieller antiviraler Wirkstoffe in klinisch relevanten Konzentrationen erforderlich.

Das kreisförmige Genom des BKPyV besteht aus ca. 5 kb, die eine nicht-kodierende Kontrollregion (NCCR) beherbergen, die als Ursprung der Replikation dient und gleichzeitig als bidirektionaler Promotor, der die Expression von mRNA-Transkripten der frühen und späten Phase antreibt. Da spontan auftretende NCCR-Umlagerungen, Deletionen und Duplizierungen bei pathogenen BKPyV8 gefunden und bei Patienten mit PVAN5,9signifikant angesammelt werden, wird ein Vergleich von archetypischen (wt) und neu arrangierte (rr) NCCR-Aktivitäten sind hilfreich, um virale reproduziertive Fitness zu charakterisieren.

Wie in Abbildung 1zusammengefasst, beschreibt dieses Protokoll eine häufig verwendete Methode zur Messung der BKPyV NCCR-Transkriptionsaktivität durch Quantifizierung der Fluoreszenz von zwei Fluorophoren tdTomato und eGFP, ausgedrückt aus einem Reporterplasmid5, 9,10,11. Das Verfahren wird in Gegenwart des SV40 large T Antigens (lTAg) durchgeführt, das es ermöglicht, die Auswirkungen potenzieller antiviraler Wirkstoffe auf die frühe und späte NCCR-Aktivität separat zu analysieren5. Dieser Assay analysiert weiter die Auswirkungen von Umlagerungen auf die NCCR-Aktivität und vergleicht mit wt-NCCRs5,9. Das Reporter-Plasmid enthält das SV40-Spätpolyadenylierungssignal nach jedem offenen Leserahmen des Fluorophors, um eine vergleichbare und effiziente Verarbeitung beider Transkripte für tdTomato bzw. eGFP zu gewährleisten. Im Vergleich zu den qRT-PCR-basierten Methoden5,12stellt dieser FACS-basierte Ansatz eine kostengünstige und hohe Durchsatz-kompatible Alternative dar, da keine komplizierten Extraktionsprotokolle für infizierte Zellkultur und keine teuren Antikörper für Immunfluoreszenzfärbung sind erforderlich. Da darüber hinaus eine definierte Menge an fluoreszierenden Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert wird, ist die Analyse von Zellzyklushemmungsmitteln auch quantitativ möglich.

Protocol

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Humanforschung, die vom Ethikausschuss der Medizinischen Fakultät der Universität Duisburg-Essen (14-6028-BO) gebilligt wurden. 1. Entnahme von Blut- oder Urinproben und Isolierung der Polyomavirus-DNA Sammeln Sie mindestens 3 ml Blut in EDTA-Röhrchen oder Urin in Anschaffungsröhrchen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 2.500 x g für 15 min. Bei Bedarf Pipettenplasma in eine neue Röhre geben und die Plasmaproben mehrer…

Representative Results

In diesem repräsentativen Experiment wurde die von BK-Polyomavirus Non-Coding Control Region gesteuerte Transkriptionsaktivität mittels Durchflusszytometrie gemessen. Darüber hinaus wurde ein mTOR-Hemmer, der zur Behandlung von Patienten nach BKPyV-Reaktivierung eingesetzt werden könnte, auf seine Hemmung der viralen frühen Genexpression getestet. Zu diesem Zweck wurde ein dualer Fluoreszenz-Reporter-Assay verwendet, wie zuvor veröffentlicht5. Das gesamte Wor…

Discussion

In diesem Artikel wird eine häufig verwendete Methode vorgestellt, die die Analyse der BKPyV-Nicht-Kodierungssteuerungsregion (NCCR) ermöglicht, die von einer frühen und späten Promotoraktivität getrieben wird. Die NCCR-Aktivität kann gleichzeitig gemessen werden und benötigt keine Lyse der transfizierten Zellen. Darüber hinaus kann eine relativ große Anzahl von Zellen analysiert werden und die Ko-Transfektion zusätzlicher Marker zur Normalisierung der Fluoreszenzwerte ist nicht notwendig.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Barbara Bleekmann für die hervorragende technische Unterstützung. Unterstützt wurden diese Studien durch das IFORES-Programm der Medizinischen Hochschule Duisburg-Essen und das RIMUR-Programm der Universitätsallianz Ruhr und das Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Die Autoren danken der Jürgen-Manchot-Stiftung für das Promotionsstipendium von Helene Sertznig und die ständige Unterstützung. Die Sammlung und Verwendung von Patientenmaterial wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Duisburg-Essen (14-6028-BO) genehmigt.

Materials

100 bp ladder NEB N3231 Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted
2-log ladder NEB N0550 Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted
Agar-Agar, Kobe I Carl Roth 5210.3
AgeI-HF NEB R3552
Ampicillin Natriumsalz Cellpure Carl Roth HP62.1
Aqua ad iniectabilia Bbraun 2351744 can be substituted by any manufacturer
BD FACSCanto™ II BD Biosciences
BD FACSDiva BD Biosciences
DAPI Sigma 10236276001
DFC450C camera module Leica Any camera can be used
DMEM Gibco 41966-029 can be substituted by any manufacturer
DMIL LED microscope Leica Any fluorescence microscope can be used
DNA Blood Mini Kit Qiagen 51104 can be substituted by any manufacturer
E.coli DH5alpha Competent Cells Thermo Scientific 18258012
FBS Superior MerckMillipore 50615 Any FBS can be used
FlowJo v10.5.3 FlowJo, LLC Any flow cytometry software FBS can be used
Gel Loading Dye, Purple (6X)  NEB B7024 Any 6x loading dye can be substituted
HEK293T cells ATCC 11268 These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.
HERAcell® 240i CO2 Incubator Thermo Scientific can be substituted by any manufacturer
HotStar PCR kit Qiagen 203203
Intas Gel documentation system Intas Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used
Low Melt Agarose Biozym 850081 can be substituted by any manufacturer
Opti-MEM Invitrogen 31985070 can be substituted by any manufacturer
pBKV (34-2) ATCC 45025 Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983
PBS Gibco 14190-136
PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler Bio-Rad discontinued product Any thermocycler can be used
PCR Nucleotide Mix, 10 mM Promega #C1145 can be substituted by any manufacturer
PCR1 and PCR2 Primers metabion not applicable Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water
PenStrep (100x) Gibco 15140-122 can be substituted by any manufacturer
Roti®-GelStain Carl Roth 3865 A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration
SpeI-HF NEB R3133
T4-DNA Ligase NEB M0202
TransIT LT1 Mirus MIR2300
Trypsin 0.05% – EDTA Gibco 25300-054 can be substituted by any manufacturer
ZymoPURE II Plasmid Kit Zymo D4201 can be substituted by any manufacturer

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Korth, J., Sertznig, H., Moyrer, S., Doevelaar, A. A. N., Westhoff, T. H., Babel, N., Witzke, O., Kribben, A., Dittmer, U., Widera, M. Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (149), e59755, doi:10.3791/59755 (2019).

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