Modelo pré-clínico de doação cardíaca após a morte circulatória
Summary
Este protocolo apresenta uma abordagem simples e flexível para a avaliação de novos agentes condicionantes ou estratégias para aumentar a viabilidade da doação cardíaca após a morte circulatória.
Abstract
A demanda de transplante cardíaco está em ascensão; no entanto, a disponibilidade de órgãos é limitada devido a uma escassez de doadores adequados. A doação de órgãos após a morte circulatória (DCD) é uma solução para abordar essa disponibilidade limitada, mas devido a um período de isquemia morna prolongada e ao risco de lesão tecidual, seu uso rotineiro no transplante cardíaco raramente é observado. Neste manuscrito nós fornecemos um protocolo detalhado que imita pròxima práticas clínicas atuais no contexto de DCD com monitoração contínua da função de coração, permitindo a avaliação de estratégias e de intervenções cardioprotetores novas para diminuir lesão de isquemia-reperfusão.
Neste modelo, o protocolo de DCD é iniciado em ratos de Lewis anestesiados parando a ventilação para induzir a morte circulatória. Quando a pressão arterial sistólica cai abaixo de 30 mmHg, o tempo de isquemia quente é iniciado. Após um período isquêmico morno pré-ajustado, os corações são liberados com uma solução cardioplégica normotérmica, adquiridos, e montados em um sistema ex vivo da perfusão do coração de Langendorff. Após 10 min de reperfusão inicial e estabilização, o condicionamento cardíaco é continuamente avaliado por 60 min usando a monitorização da pressão intraventricular. Um ferimento de coração é avaliado medindo o troponina cardíaco T e o tamanho do enfarte é quantificado pela mancha histológica. O tempo de isquemia quente pode ser modulado e adaptado para desenvolver a quantidade desejada de danos estruturais e funcionais. Este protocolo simples permite a avaliação de diferentes estratégias de condicionamento cardioprotetor introduzidas no momento da cardioplegia, reperfusão inicial e/ou durante a perfusão ex vivo. Os achados obtidos nesse protocolo podem ser reproduzidos em grandes modelos, facilitando a tradução clínica.
Introduction
A transplantação contínua do órgão no transplante geral e cardíaco, em particular, está na ascensão Worldwide1,2. O método padrão de suprimento de órgãos é a doação após a morte encefálica (DBD). Dado os critérios estritos da inclusão de DBD, menos de 40% dos corações oferecidos são aceitados3, limitando desse modo a oferta frente à demanda crescente e estendendo a lista de espera do órgão. Para abordar esse problema, o uso de órgãos doados após a morte circulatória (DCD) é considerado uma solução potencial4.
No entanto, em doadores de DCD, uma fase agonal após a retirada do cuidado e um período de isquemia morna desprotegida antes da ressuscitação são inevitáveis5. A lesão potencial do órgão após a morte circulatória pode conduzir à deficiência orgânica do órgão, explicando a relutância para adotar rotineiramente transplantações do coração de DCD. É relatado que apenas 4 centros utilizam o DCD Hearts clinicamente, com critérios rigorosos que incluem tempos de isquemia quente muito curtos e jovens doadores sem patologias crônicas6,7. Por razões éticas e jurídicas, intervenções cardioprotetoras limitadas ou não podem ser aplicadas em doadores antes da morte circulatória5,8,9. Assim, qualquer mitigação para aliviar a lesão de isquemia-reperfusão (IR) é limitada a terapias cardioprotetoras iniciadas durante a reperfusão precoce com soluções cardioplémicas, e não permitem uma avaliação funcional adequada. A perfusão cardíaca ex vivo (evhp) e o recondicionamento do coração de DCD utilizando plataformas dedicadas têm sido propostos como uma solução alternativa eestudados por vários estudiosos10,11,12,13 . A EVHP oferece uma oportunidade única de entregar agentes de pós-condicionamento aos corações DCD para melhorar a recuperação funcional. No entanto, para uma tradução clínica eficiente, muitas questões técnicas e práticas continuam a ser abordadas, e isso é agravado pela falta de consenso sobre uma gama de perfusão e critérios funcionais para determinar a transplantabilidade6, a 8.
Nisto nós relatamos o desenvolvimento de um protocolo pequeno animal pré-clínico reprodutível de DCD combinado com um sistema ex vivo da perfusão do coração que possa ser usado para investigar o borne-condicionamento do órgão iniciado na altura da colheita, durante o reperfusion inicial, e /ou em todo o EVHP.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado aqui apresenta um modelo simples, conveniente e versátil de DCD cardíaco, oferecendo a oportunidade de avaliar a recuperação funcional cardíaca, dano tecidual e o uso de agentes cardioprotetores pós-condicionamento para melhorar a recuperação do doador os corações rejeitados de outra forma para transplante. Sistemas de perfusão cardíaca ex vivo (EVHP) foram otimizados para fornecer uma plataforma para avaliar a função cardíaca e oferecer uma oportunidade única de entregar e testar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Partes deste trabalho foram apoiadas por uma generosa contribuição da Fondation Marcel et Rolande Gosselin e Fondation Sr. stefane Foumy. Nicolas Noiseux é estudioso do FRQ-S.
Os autores desejam agradecer a Josh Zhuo Le Huang, Gabrielle Gascon, Sophia Ghiassi, e Catherine Scalabrini por seu apoio na coleta de dados.
Materials
| 0,9% Sodium Chloride. 1L bag | Baxter | Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system. | |
| 14G 2" I.V catheter | Jelco | 4098 | To act as endotracheal tube. |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Milipore-Sigma | T8877 | Vital coloration |
| 22G 1" I.V catheter | BD | 383532 | I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization |
| Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr | Skalar | 50-3147 | Additional forceps for tissue manipulation |
| Alm Self-retaining retractor 4×4 Teeth Blunt 2-3/4" | Skalar | 22-9027 | Tissue retractor used to maintain the chest open. |
| Bridge amp | ADinstruments | FE221 | Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement |
| Calcium chloride | Milipore-Sigma | C1016 | CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution |
| D-(+)-Glucose | Milipore-Sigma | G8270 | D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| DIN(8) to Disposable BP Transducer | ADinstruments | MLAC06 | Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer |
| Disposable BP Transducer (stopcock) | ADinstruments | MLT0670 | Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement |
| dPBS | Gibco | 14190-144 | Electrolyte solution without calcium or magnesium. |
| Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4" | Skalar | 66-2740 | Additional forceps for tissue manipulation |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Milipore-Sigma | HT501128 | Fixative solution |
| Heating Pad | Sunbean | 756-CN | |
| Heparin sodium 1000 UI/mL | Sandoz | For systemic anticoagulation | |
| Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0% | Fisher scientific | A144-500 | Diluted 1:1 for pH correction |
| Ketamine | Bimeda | Anesthetic. 100 mg/ml | |
| LabChart | ADinstruments | Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled | |
| Left ventricle pressure balloon | Radnoti | 170404 | In latex. Size 4. |
| Lidocaine HCl 2% solution | AstraZeneca | Antiarrhythmic for the cardioplegic solution | |
| Magnesium Chloride ACS | ACP Chemicals | M-0460 | MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Micro pressure sensor | Radnoti | 159905 | Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon |
| Pacemaker | Biotronik | Reliaty | Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm. |
| pH bench top meter | Fisher scientific | AE150 | |
| Physiological monitor | Kent Scientific | Physiosuite | For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure |
| Plasma-Lyte A | Baxter | Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia | |
| Potassium Chloride | Milipore-Sigma | P4504 | KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Potassium Chloride 2 meq/ml | Hospira | Part of the cardioplegic solution | |
| PowerLab 8/30 Polygraph | ADinstruments | Electronic polygraph | |
| Silk 2-0 | Ethicon | A305H | Suture material for Langendorff apparatus |
| Silk 5-0 | Ethicon | A302H | Suture material for carotid |
| Small animal anesthesia workstation | Hallowell EMC | 000A2770 | Small animal ventilator |
| Sodium bicarbonate | Milipore-Sigma | S5761 | NaHCO3 ≥99,5% Part of the Krebs solution |
| Sodium Chloride | Milipore-Sigma | S7653 | NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| Sodium Hydroxide pellets | ACP chemicals | S3700 | Diluted to 5N (10 g in 50 ml) for pH correction |
| Sodium phosphate monobasic | Milipore-Sigma | S0751 | NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2" | Skalar | 22-1240 | Small scisors for atria and cava vein opening |
| Tissue slicer blades | Thomas scientific | 6727C18 | Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol |
| Tuberculin safety syringe with needle 25G 5/8" | CardinalHealth | 8881511235 | For heparin injection |
| Veterinary General Surgery Set | Skalar | 98-1275 | Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps |
| Veterinary Micro Set | Skalar | 98-1311 | Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening |
| Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system | Radnoti | 120101BEZ | Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock |
| Xylazine | Bayer | Sedative. 20 mg/ml |
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