Modelo preclínico de donación cardíaca después de la muerte circulatoria
Summary
Este protocolo muestra un enfoque simple y flexible para la evaluación de nuevos agentes acondicionadores o estrategias para aumentar la viabilidad de la donación cardíaca después de la muerte circulatoria.
Abstract
La demanda de trasplantes cardíacos está en aumento; sin embargo, la disponibilidad de órganos es limitada debido a la escasez de donantes adecuados. La donación de órganos después de la muerte circulatoria (DCD) es una solución para abordar esta disponibilidad limitada, pero debido a un período de isquemia cálida prolongada y el riesgo de lesión tisular, su uso rutinario en trasplante cardíaco rara vez se ve. En este manuscrito proporcionamos un protocolo detallado que imita estrechamente las prácticas clínicas actuales en el contexto de la DCD con monitoreo continuo de la función cardíaca, lo que permite la evaluación de nuevas estrategias e intervenciones cardioprotectoras para disminuir lesión por reperfusión de isquemia.
En este modelo, el protocolo DCD se inicia en ratas Lewis anestesiadas deteniendo la ventilación para inducir la muerte circulatoria. Cuando la presión arterial sistólica cae por debajo de 30 mmHg, se inicia el tiempo isquémico cálido. Después de un período isquémico cálido preconfigurado, los corazones se enjuadean con una solución cardiopléjica normotérmica, se obtienen y se montan en un sistema de perfusión cardíaca ex vivo de Langendorff. Después de 10 minutos de reperfusión inicial y estabilización, el reacondicionamiento cardíaco se evalúa continuamente durante 60 minutos utilizando la monitorización de la presión intraventricular. Una lesión cardíaca se evalúa midiendo la troponina T cardíaca y el tamaño del infarto se cuantifica mediante tinción histológica. El tiempo isquémico cálido se puede modular y adaptar para desarrollar la cantidad deseada de daño estructural y funcional. Este sencillo protocolo permite la evaluación de diferentes estrategias de acondicionamiento cardioprotectores introducidas en el momento de cardioplejia, reperfusión inicial y/o durante la perfusión ex vivo. Los hallazgos obtenidos de este protocolo se pueden reproducir en grandes modelos, facilitando la traducción clínica.
Introduction
El trasplante de órganos sólidos en general y el trasplante cardíaco, en particular, van en aumento en todo el mundo1,2. El método estándar de adquisición de órganos es la donación después de la muerte cerebral (DBD). Dados los estrictos criterios de inclusión de DBD,se aceptan menos del 40% de los corazones ofrecidos 3, limitando así la oferta frente al aumento de la demanda y ampliando la lista de espera de órganos. Para abordar este problema, el uso de órganos donados despuésde la muerte circulatoria (DCD) se considera una posible solución 4.
En los donantes de DCD, sin embargo, una fase agonal después de la retirada de la atención y un período de isquemia cálida sin protección antes de la reanimación son inevitables5. La posible lesión de órganos después de la muerte circulatoria puede conducir a la disfunción del órgano, lo que explica la renuencia a adoptar rutinariamente trasplantes cardíacos DCD. Se informa que sólo 4 centros utilizan los corazones DCD clínicamente, con criterios estrictos que incluyentiempos de isquemia cálida muy cortos y jóvenes donantes sin patologías crónicas 6,7. Por razones éticas y legales, se pueden aplicar intervenciones cardioprotectoras limitadas o sin cardioprotectores en donantes antes de la muerte circulatoria5,8,9. Por lo tanto, cualquier mitigación para aliviar la lesión isquemia-reperfusión (IR) se limita a las terapias cardioprotectoras iniciadas durante la reperfusión temprana con soluciones cardiopléjicos, y no permiten una evaluación funcional adecuada. La perfusión cardíaca ex vivo (EVHP) y el reacondicionamiento del corazón DCD utilizando plataformas dedicadas han sido propuestos como una solución alternativa y estudiado por varios estudiosos10,11,12,13 . EVHP ofrece una oportunidad única para entregar agentes post-acondicionado a los corazones de DCD para mejorar la recuperación funcional. Sin embargo, para una traducción clínica eficiente, quedan muchas cuestiones técnicas y prácticas por abordar, y esto se agrava aún más por la falta de consenso sobre una serie de criterios de perfusión y funcionales para determinar la trasplantabilidad6, 8.
Aquí informamos del desarrollo de un protocolo preclínico de DCD preclínico preclínico de DCD combinado con un sistema de perfusión cardíaca ex vivo que se puede utilizar para investigar el postcondicionamiento de órganos iniciado en el momento de la adquisición, durante la reperfusión inicial, y /o a través de EVHP.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado aquí introduce un modelo simple, conveniente y versátil de DCD cardíaco, que ofrece la oportunidad de evaluar la recuperación funcional cardíaca, el daño tisular y el uso de agentes cardioprotectores post-acondicionadopara mejorar la recuperación del donante corazones de lo contrario desechados para el trasplante. Los sistemas de perfusión cardíaca ex vivo (EVHP) se han optimizado para proporcionar una plataforma para evaluar la función cardíaca y ofrecer una oportunidad única para ofr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Algunas partes de este trabajo fueron apoyadas por una generosa contribución de la Fundación Marcel et Rolande Gosselin y la Fundación Sr. Stefane Foumy. Nicolas Noiseux es estudioso del FRQ-S.
Los autores desean agradecer a Josh Zhuo Le Huang, Gabrielle Gascon, Sophia Ghiassi y Catherine Scalabrini por su apoyo en la recopilación de datos.
Materials
| 0,9% Sodium Chloride. 1L bag | Baxter | Electrolyte solution for flushing in the modified Langendorff system. | |
| 14G 2" I.V catheter | Jelco | 4098 | To act as endotracheal tube. |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Milipore-Sigma | T8877 | Vital coloration |
| 22G 1" I.V catheter | BD | 383532 | I.V catheter with extension tube that facilitates manipulation for carotid catheterization |
| Adson Dressing Fcp, 4 3/4", Serr | Skalar | 50-3147 | Additional forceps for tissue manipulation |
| Alm Self-retaining retractor 4×4 Teeth Blunt 2-3/4" | Skalar | 22-9027 | Tissue retractor used to maintain the chest open. |
| Bridge amp | ADinstruments | FE221 | Bridge amp for intracarotid blood pressure measurement |
| Calcium chloride | Milipore-Sigma | C1016 | CaCl2 anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0% Part of the Krebs solution |
| D-(+)-Glucose | Milipore-Sigma | G8270 | D-Glucose ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| DIN(8) to Disposable BP Transducer | ADinstruments | MLAC06 | Adapter cable for link between bridge amp and pressure transducer |
| Disposable BP Transducer (stopcock) | ADinstruments | MLT0670 | Pressure transducer for intracarotid blood pressure measurement |
| dPBS | Gibco | 14190-144 | Electrolyte solution without calcium or magnesium. |
| Eye Dressing Fcp, Str, Serr, 4" | Skalar | 66-2740 | Additional forceps for tissue manipulation |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Milipore-Sigma | HT501128 | Fixative solution |
| Heating Pad | Sunbean | 756-CN | |
| Heparin sodium 1000 UI/mL | Sandoz | For systemic anticoagulation | |
| Hydrochloric Acid 36,5 to 38,0% | Fisher scientific | A144-500 | Diluted 1:1 for pH correction |
| Ketamine | Bimeda | Anesthetic. 100 mg/ml | |
| LabChart | ADinstruments | Control software for the Powerlab polygraph, allowing off-line analyses. Version 7, with blood pressure and PV loop modules enabled | |
| Left ventricle pressure balloon | Radnoti | 170404 | In latex. Size 4. |
| Lidocaine HCl 2% solution | AstraZeneca | Antiarrhythmic for the cardioplegic solution | |
| Magnesium Chloride ACS | ACP Chemicals | M-0460 | MgCl2+6H2O ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Micro pressure sensor | Radnoti | 159905 | Micro pressure sensor and amplifier connected to the intraventricular balloon |
| Pacemaker | Biotronik | Reliaty | Set to generate a pulse each 200 ms for a heart rate of 300 bpm. |
| pH bench top meter | Fisher scientific | AE150 | |
| Physiological monitor | Kent Scientific | Physiosuite | For continuous monitoring of rodent temperature and saturation during the procedure |
| Plasma-Lyte A | Baxter | Electrolyte solution used as base to prepare cardioplegia | |
| Potassium Chloride | Milipore-Sigma | P4504 | KCl ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Potassium Chloride 2 meq/ml | Hospira | Part of the cardioplegic solution | |
| PowerLab 8/30 Polygraph | ADinstruments | Electronic polygraph | |
| Silk 2-0 | Ethicon | A305H | Suture material for Langendorff apparatus |
| Silk 5-0 | Ethicon | A302H | Suture material for carotid |
| Small animal anesthesia workstation | Hallowell EMC | 000A2770 | Small animal ventilator |
| Sodium bicarbonate | Milipore-Sigma | S5761 | NaHCO3 ≥99,5% Part of the Krebs solution |
| Sodium Chloride | Milipore-Sigma | S7653 | NaCl ≥99.5% Part of the Krebs solution |
| Sodium Hydroxide pellets | ACP chemicals | S3700 | Diluted to 5N (10 g in 50 ml) for pH correction |
| Sodium phosphate monobasic | Milipore-Sigma | S0751 | NaH2PO4 ≥99.0% Part of the Krebs solution |
| Stevens Tenotomy Sciss, Str, Delicate, SH/SH, 4 1/2" | Skalar | 22-1240 | Small scisors for atria and cava vein opening |
| Tissue slicer blades | Thomas scientific | 6727C18 | Straight carbon steel blades for tissue slicing at the end of the protocol |
| Tuberculin safety syringe with needle 25G 5/8" | CardinalHealth | 8881511235 | For heparin injection |
| Veterinary General Surgery Set | Skalar | 98-1275 | Surgery instruments including disection scisors and mosquito clamps |
| Veterinary Micro Set | Skalar | 98-1311 | Surgery instruments with microscisors used for carotid artery opening |
| Working Heart Rat/Guinea Pig/Rabbit system | Radnoti | 120101BEZ | Modular working heart system modified for the needs of the protocol. Includes all the necesary tubbing, water jacketed reservoirs and valves, including 2 and 3 way stop cock |
| Xylazine | Bayer | Sedative. 20 mg/ml |
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