Ultraschall-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll, um primäre erwachsene Fibroblasten auf einfache, schnelle und zuverlässige Weise zu isolieren, die von Anfängern (z. B. Studenten) durchgeführt werden können. Das Verfahren kombiniert enzymatische Gewebeverdauung und mechanische Agitation mit Ultraschallwellen, um primäre Fibroblasten zu erhalten. Das Protokoll kann leicht an spezifische experimentelle Anforderungen (z.B. menschliches Gewebe) angepasst werden.
Abstract
Primäre erwachsene Fibroblasten sind zu einem wichtigen Werkzeug geworden, um Fibrose, Fibroblasten-Wechselwirkungen und Entzündungen in allen Körpergeweben zu untersuchen. Da sich primäre Fibroblasten aufgrund der Myofibroblastendifferenzierung oder der Seneszenzinduktion nicht unbegrenzt aufteilen können, müssen regelmäßig neue Kulturen etabliert werden. Es gibt jedoch mehrere Hindernisse, die während der Prozesse der Entwicklung eines zuverlässigen Isolationsprotokolls und der primären Fibroblastenisolation selbst zu überwinden sind: der Schwierigkeitsgrad der Methode (insbesondere für Anfänger), das Risiko einer bakteriellen Kontamination, die benötigte Zeit, bis primäre Fibroblasten für Experimente verwendet werden können, und anschließende Zellqualität und Lebensfähigkeit. In dieser Studie wird ein schnelles, zuverlässiges und leicht zu erlernendes Protokoll zur Isolierung und Kultur primärer Erwachsener Fibroblasten aus Mausherz, Lunge, Leber und Niere bereitgestellt, das enzymatische Verdauung und Ultraschall-Agitation kombiniert.
Introduction
Fibroblasten sind flache, spindelförmige Zellen mit mehreren stellaten Prozessen und einem ausgedehnten groben endoplasmatischen Retikulum1,2. Ein durchschnittlicher Fibroblasten misst 30 – 100 m und hat eine Lebensdauer von 57 x 3 Tagen1,3. Die durchschnittliche Zellzyklusdauer menschlicher Fibroblasten reicht von 16 – 48 h, abhängig von den Kulturbedingungen4. Es gibt Hinweise darauf, dass die reproduktive Kapazität und funktionelle Qualität kultivierter primärer Fibroblasten negativ mit dem Spenderalter korreliert, was darauf hindeutet, dass jüngere Spender (Tiere oder Patienten) nach Möglichkeit bevorzugt werden sollten5,6 .
Fibroblasten stellen einen vorherrschenden Zelltyp der meisten Säugetierkörpergewebe dar. Trotz ihrer allgegenwärtigen Präsenz ist die molekulare Identifizierung von Fibroblasten immer noch eine Herausforderung7. Fibroblasten wandern während der embryonalen Entwicklung zu sich entwickelnden Geweben und Organen aus verschiedenen Quellen8. Aus diesem Grund gibt es eine Fülle von Markerproteinen, die in Fibroblasten gefunden werden können, während einzigartige Markerproteine, die in jeder Fibroblastenpopulation vorhanden sind und exklusiv für Fibroblasten sind, noch fehlen. Daher werden Expressionsmuster mehrerer erkannter Marker in der Regel verwendet, um Fibroblasten zu identifizieren. Zu den bekanntesten Markern gehören Vimentin, humanes Fibroblasten-Oberflächenprotein (hFSP), Discoidin-Domänenrezeptor 2 (DDR2) und Alpha-Glattmuskel-Actin (SMA).
Fibroblasten sind der wichtigste extrazelluläre Matrix (ECM)-produzierende Zelltyp. Dabei erhalten Fibroblasten eine geordnete Gewebearchitektur und bieten mechanische Unterstützung für benachbarte Zellen1. Das Gleichgewicht zwischen ECM-Synthese und Abbau ist ein gut regulierter Prozess. Verschiebungen in Richtung Synthese markieren den Beginn einer übermäßigen ECM-Ablagerung, die, wenn sie nicht beendet wird, zu Fibrose führt. Fibrose wird durch Myofibroblasten vermittelt, die von aktivierten Fibroblasten stammen, die molekularen und phänotypischen Veränderungen unterzogen werden. Ein Markenzeichen von Myofibroblasten ist die verbesserte Sekretion von ECM und Zytokinen und die Expression von geordnetangeordneten SMA-Mikrofilamenten9.
Primäre Fibroblasten standen im Rampenlicht der jüngsten Forschung, die sich auf Fibrose, Gewebeentzündung und Fibroblasten-Krebs-Zell-Wechselwirkungen10,11konzentriert. Jedoch, um effektiv zu studieren Fibroblasten Eigenschaften in Gesundheit und Krankheit, Ist es notwendig, lebensfähige primäre erwachsene Fibroblasten auf einer regelmäßigen Basis zu isolieren. Es stehen mehrere Methoden zur Verfügung, um Fibroblasten zu isolieren12,13,14. Die drei wichtigsten Methoden der Fibroblastenisolation sind das Auswachsen aus Gewebebrocken12, enzymatische Gewebeverdauung15, und enzymatische Perfusion von Hohlorganen9,13,16. Der Vorteil des Auswuchses ist ein schonender Isolationsprozess ohne enzymatischen Zellabbau. Auf der anderen Seite benötigen Auswachstumskulturen in der Regel längere Kulturperioden, bis Zellen für Experimente verwendet werden können. Die häufige enzymatische Verdauung ist schnell, birgt aber das Risiko einer Kontamination mit anderen Zelltypen (z. B. Endothelzellen) oder Bakterien im Rührprozess, die notwendig sind, um das Gewebe mechanisch aufzulösen. Darüber hinaus sind diese Methoden oft aufwendig und erfordern Zeit und Geschick zu lernen.
Hinsichtlich der Bedeutung primärer Fibroblasten in der Forschung besteht nach wie vor die Notwendigkeit, bestehende Zellisolationsansätze in Bezug auf Schnelligkeit, Einfachheit und Zuverlässigkeit zu optimieren. Hier wird eine neuartige Ultraschall-basierte enzymatische Fibroblasten-Isolationsmethode angeboten, die hochwertige Zellen liefert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im Vergleich zu verewigten Fibroblasten-Zelllinien bieten primäre Fibroblasten mehrere Vorteile. Sie lassen sich kostengünstig in hoher Qualität und Quantität isolieren. Darüber hinaus bieten Primärkulturen die Möglichkeit, Zellen von mehreren Individuen zu untersuchen, was die Zuverlässigkeit der erhaltenen Ergebnisse erhöht und die Wahrscheinlichkeit verringert, nur Zellkulturartefakte zu studieren. Kontinuierliche Erzeugung neuer Primärkulturen verhindert genetische Veränderungen, die häufig nach wiederhol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Frau Romy Kempe und Frau Annett Opitz für die fachkundige technische Unterstützung. Wir danken auch Herrn Bjoern Binnewerg für die IT-Unterstützung. Unterstützt wurde diese Arbeit durch Stipendien des Förderkreises Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) “Habilitationsförderprogramm für Frauen”, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus Dresden und c) Else Kröner-Forschungskolleg (EKFK) Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus Dresden. Wir sind dankbar für die Finanzierung und die Unterstützung.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antibiotics | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml) |
| Cell culture hood | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Cell culture plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | depends on vessel | 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC professional suction |
| Cell strainer (mesh) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm Nylon |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| Cordless pipetting controller | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| Disposable pipette tips | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | SafeSeal tips for pipettes (10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl) |
| Disposable plastic pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml |
| Disposable sterile scalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.a. | Techno cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | depends on volume | 50 µl, 500 µl, 1.500µl, 2.000 µl |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Collagenase blend | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 ml |
| Senescence detection kit | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a. | MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Sterile plastic tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml) |
| Ultrasonic water bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| Surgical scissors (atraumatic) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| Surgical scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | eq 1060.09 | |
| Surgical forceps | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BD577 |
References
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