Ultralyd-forstærket primær voksen fibroblast isolation
Summary
Vi præsenterer en protokol for at isolere primære voksne fibroblaster på en nem, hurtig og pålidelig måde, performable af begyndere (f. eks. studerende). Proceduren kombinerer enzymatisk vævs nedbrydning og mekanisk agitation med ultralydbølger for at opnå primære fibroblaster. Protokollen kan let tilpasses specifikke eksperimentelle krav (f. eks. humant væv).
Abstract
Primære voksne fibroblaster er blevet et vigtigt redskab til at studere fibrose, fibroblast interaktioner og inflammation i alle kropsvæv. Da primære fibroblaster ikke kan opdeles på ubestemt tid på grund af myofibroblast differentiering eller senescens induktion, skal nye kulturer etableres regelmæssigt. Men der er flere forhindringer at overvinde i løbet af processerne med at udvikle en pålidelig isolations protokol og primær fibroblast isolation selv: metodens sværhedsgrad (især for begyndere), risikoen for bakteriel kontaminering, nødvendig tid, indtil primære fibroblaster kan bruges til eksperimenter, og efterfølgende celle kvalitet og levedygtighed. I denne undersøgelse, en hurtig, pålidelig og nem at lære protokol til at isolere og kultur primære voksne fibroblaster fra mus hjerte, lunge, lever og nyrer, der kombinerer enzymatisk fordøjelse og ultralyd agitation.
Introduction
Fibroblaster er flade, spindel formede celler med flere stellat processer og en omfattende ru endoplasmatiske reticulum1,2. En gennemsnitlig fibroblast måler 30-100 μm og har en levetid på 57 ± 3 dage1,3. Den gennemsnitlige celle cyklus varighed af humane fibroblaster spænder fra 16-48 h afhængigt af dyrkningsbetingelserne4. Der er tegn på, at den replikerende kapacitet og funktionelle kvalitet af dyrkede primære fibroblaster negativt korrelerer med donor alderen, hvilket tyder på, at yngre donorer (dyr eller patienter) bør foretrækkes, hvis det er muligt,5,6 .
Fibroblaster udgør en fremherskende celletype af de fleste pattedyr kropsvæv. På trods af deres allestedsnærværende tilstedeværelse, er den molekylære identifikation af fibroblaster stadig en udfordring7. Fibroblaster migrerer til udvikling af væv og organer fra forskellige kilder under fosterudvikling8. Af denne grund er der en overflod af markør proteiner, der kan findes i fibroblaster, mens unikke markør proteiner, som er til stede i hver fibroblast befolkning og eksklusiv for fibroblaster, stadig mangler. Således udtryk mønstre af flere anerkendte markører er normalt bruges til at identificere fibroblaster. Blandt de mest anerkendte markører er vimentin, humant fibroblast overflade protein (hFSP), diskoidin domæne receptor 2 (DDR2) og alpha glat muskel actin (αSMA).
Fibroblaster er den vigtigste ekstracellulære matrix (ECM)-producerende celletype. Derved opretholder fibroblaster en velordnet vævs arkitektur og yder mekanisk støtte til tilstødende celler1. Balancen mellem ECM syntese og nedbrydning er en velreguleret proces. Forskydninger mod syntese markere begyndelsen af overdreven ECM deposition, som, hvis ikke afsluttet, fører til fibrose. Fibrose medieres af myofibroblaster, som stammer fra aktiverede fibroblaster, der gennemgår molekylære og fænotypiske forandringer. Et kendetegn for myofibroblaster er øget sekretion af ECM og cytokiner og udtrykket af ordnede arrangeret αSMA Micro filamenter9.
Primære fibroblaster har været i rampelyset for nylig forskning med fokus på fibrose, vævs betændelse og fibroblast-cancer-celle interaktioner10,11. Men for effektivt at studere fibroblast egenskaber i sundhed og sygdom, er det nødvendigt at isolere levedygtige primære voksne fibroblaster på en regelmæssig basis. Der er flere metoder til rådighed til at isolere fibroblaster12,13,14. De tre vigtigste metoder til fibroblast isolation er udvækst fra væv bidder12, enzymatisk væv fordøjelse15, og enzymatisk perfusion af hule organer9,13,16. Fordelen ved udvækst er en blid isolations proces uden enzymatisk cellenedbrydning. På den anden side, udvækst kulturer normalt kræver langvarig kultur perioder, indtil cellerne kan bruges til eksperimenter. Almindelig enzymatisk fordøjelse er hurtig, men bærer en risiko for kontaminering med andre celletyper (f. eks. endotelceller) eller bakterier i agitations processen, hvilket er nødvendigt for mekanisk at opløse vævet. Desuden er disse metoder ofte udførlige og kræver tid og dygtighed til at lære.
Med hensyn til vigtigheden af primære fibroblaster i forskning, er der stadig behov for at optimere eksisterende celle isolation tilgange i form af hurtighed, enkelhed og pålidelighed. Her leveres en roman ultralyds baseret enzymatisk fibroblast isolationsmetode, der leverer højkvalitets celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sammenlignet med udødeliggjort fibroblast cellelinjer, primære fibroblaster giver flere fordele. De kan være isolerede omkostninger effektivt i høj kvalitet og kvantitet. Endvidere, primære kulturer giver mulighed for at studere celler fra flere individer, hvilket øger pålideligheden af de opnåede resultater og mindsker sandsynligheden for blot at studere cellekultur artefakter. Kontinuerlig generation af nye primære kulturer forhindrer genetiske ændringer, som almindeligvis opstår efter gentagen passaging<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker fru Romy Kempe og fru Annett Opitz for ekspert teknisk support. Vi takker også hr. Bjoern Binnewerg for IT-støtte. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra a) Förderkreis Dresdner Herz-kreislauf-tage e.V., b) “Habilitationsförderprogramm für Frauen”, det medicinske fakultet Carl Gustav Carus Dresden og c) Else Kröner-Forschungskolleg (EKFK) Faculty of Medicine Carl Gustav Carus Dresden. Vi er taknemmelige for finansieringen og støtten.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antibiotics | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml) |
| Cell culture hood | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Cell culture plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | depends on vessel | 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface |
| Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC professional suction |
| Cell strainer (mesh) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm Nylon |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
| Cordless pipetting controller | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
| Disposable pipette tips | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | SafeSeal tips for pipettes (10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl) |
| Disposable plastic pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml |
| Disposable sterile scalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.a. | Techno cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
| Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | depends on volume | 50 µl, 500 µl, 1.500µl, 2.000 µl |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Collagenase blend | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
| Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 ml |
| Senescence detection kit | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a. | MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Sterile plastic tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml) |
| Ultrasonic water bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
| Surgical scissors (atraumatic) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
| Surgical scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | eq 1060.09 | |
| Surgical forceps | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BD577 |
References
- Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).
- Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).
- Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).
- Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).
- Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. , 445098 (2018).
- Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4 (2), (2016).
- Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).
- Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).
- Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).
- Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed – NCBI Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019)
- Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).
- Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).
