Summary
循環腫瘍細胞(CTC)の特徴付けは、翻訳研究で一般的な話題です。このプロトコルは、非小細胞肺癌(NSCLC)患者サンプルにおけるCTCのPD-L1特性測定および列挙に関する半自動免疫蛍光(IF)アッセイについて説明する。
Abstract
原発性腫瘍に由来する循環腫瘍細胞(CTC)は、血流またはリンパ系に流れ込む。これらの希少細胞(血液のmL当たり1−10細胞)は予後不良を保証し、いくつかの癌(例えば、乳房、前立腺および結腸直腸)の全体的な生存率の短さと相関する。現在、抗EpCAMコーティング磁気ビーズベースのCTC捕捉システムは、血流中のCTCを列挙するための米国食品医薬品局(FDA)によって承認されたゴールドスタンダードテストです。この試験は、特に上皮癌細胞を標的とする抗EpCAMマーカーでコーティングされた磁気ビーズの使用に基づいています。多くの研究は、EpCAMがCTC検出に最適なマーカーではないことを示しています。実際、CTCは癌細胞の不均一な亜集団であり、転移増殖および侵入に関連する上皮間葉転移(EMT)を受けることができる。これらのCTCは、細胞表面上皮マーカーEpCAMの発現を減少させ、ビメンチンなどの間葉系マーカーを増加させることができる。この技術的なハードルに対処するため、CTCの物理的特性に基づく他の分離方法が開発されている。マイクロ流体技術は、全血サンプルからのCTC濃縮に対するラベルフリーのアプローチを可能にします。スパイラルマイクロ流体技術は、スパイラルマイクロ流体チップ内で生成された曲面チャネル内の連続的な流れを持つ慣性およびディーンドラッグ力を使用します。細胞は、正常な血液細胞と腫瘍細胞の間の大きさと可塑性の違いに基づいて分離されます。このプロトコルは、プログラムされた死リガンド1(PD-L1)CTC発現を特徴付けるさまざまなステップを詳細に説明し、スパイラルマイクロ流体デバイスとカスタマイズ可能な免疫蛍光(IF)マーカーセットを組み合わせる。
Introduction
腫瘍抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)は、がん「免疫監視」と呼ばれるプロセスを通じて癌への応答に重要な役割を果たします。それらの抗腫瘍機能は、CTLA-4阻害剤およびPD-1/PD-L1阻害剤などの免疫チェックポイント遮断抗体によって増強される。非小細胞肺癌(NSCLC)では、抗PD-1/PD-L1療法は、PD-L1陰性腫瘍患者では0%~17%、PD-L1を発現する患者では36%~100%の応答率をもたらす。黒色腫およびNSCLCで観察されたPD-1/PD-L1遮断に対する強い応答は、全体的な応答率(RR)、耐久性のある臨床上の利点、および無増悪生存(PFS)の改善の証拠によって示される。現在、抗PD1治療は、PD-L1発現にかかわらずニボルマブを有する第2ラインNSCLC治療における治療の標準であり、PD-L1≥1%を発現する患者におけるペンブロリズマブを有する。第一線治療において、治療の標準は、PD-L1≥50%を発現するNSCLC患者において単独でペンブロリズマブであり、化学療法(組織学的サブタイプに応じてプラチンおよび二重薬物)1、2で潜在的に増強することができる。
しかしながら、このような患者管理へのアプローチは議論の余地がある3は、免疫組織化学(IHC)による腫瘍細胞におけるPD-L1発現は、おそらく最も理想的なコンパニオンバイオマーカーではない。腫瘍突然変異負担4(TMB)、マイクロサテライト不安定性(MSI)、および/または微生物叢などの他のものは、単独または組み合わせのいずれかでこの設定において興味深い可能性があります。NSCLCは、空間的に(腫瘍部位から別の腫瘍部位へ)または一時的に(診断から再発まで)異種腫瘍であることが知られている。NSCLCの患者は通常壊れやすく、反復的な侵襲的組織生検が問題になる可能性があります。実際、最初の進行時の再生検率は、系列に応じて46%から84%の範囲であり、成功した再生検(組織学的および完全な分子分析を伴う意味)は33%から75%の範囲である。これは、患者の25%-67%が最初の進行5、6、7、8の間に包括的な再生検分析を受けることができないことを意味する。
「液体生検」の出現は、循環由来の循環性DNA(cfDNA)を調べることにより、疾患進行時の分子変化の重要な再評価を可能にするため、この特定の設定でかなりの熱意を生み出しました。腫瘍細胞(CTC)。これらの生細胞は腫瘍から血流に放出され、そこで自由に循環する。CTCの分析は日常的に使用されていないが、肺癌における分子的および表現型的特徴付け、予後、および予測的意義の場合(DNAseq、RNAseq、miRNAおよびタンパク質分析を介して)において非常に有望であると思われる。実際、CTCは初期マーカーではなく、活性疾患の型表示特性を持つ可能性が高い(診断時に組織生検で検出される)。さらに、CTCは腫瘍組織の空間的不均一性の問題をバイパスし、これは小さな生検において重要な問題でありうる。その結果、CTC上のPD-L1発現は、腫瘍組織を用いた予測バイオマーカーとしての使用に由来する不一致を明らかにする可能性がある。
近年、PD-L1発現はNSCLCのCTCで試験されている。9を検査した患者のほとんどはPD-L1陽性であり、結果とその臨床使用の解釈を複雑にした。全体として、PD-L1陽性CTCは、平均4.5セル/mL10からのサンプルの69.4%で検出された。放射線治療の開始後、PD-L1陽性CTCの割合が有意に増加し、放射線11に応答するPD-L1発現のアップレギュレーションを示した。したがって、PD-L1 CTC分析は、化学療法、放射線、および可能性の高い免疫療法(IT)治療に対する応答を反映する腫瘍および免疫応答の動的変化を監視するために使用することができる。
現在までに、CTCの分離およびPD-L1特性化は、抗EpCAMコーティング磁気ビーズベースのCTC捕捉、濃縮フリーベースのアッセイ、サイズベースの12、13 CTCキャプチャアッセイなどの様々な方法に依存しています。しかし、CTCは転移性NSCLC患者の45%~65%でのみ検出され、転移性NSCLC患者の半数以上に情報を提供する能力が制限されました。さらに、CTC数は、サイズベースのアプローチ10を使用して、これらの研究のほとんどで低かった。さらに、この方法は、健康なドナーの血流における「悪性腫瘍の細胞形態パターン」を有するCD45(-)/DAPI(+)細胞の検出などの不一致をもたらした。これらの懸念は、NSCLCにおける追加の癌バイオマーカー(すなわち、TTF1、ビメンチン、EpCAM、およびCD44)を用いて健康な全血からの非定型CD45(-)細胞の免疫表現型に関連するCTCコレクションの高感度な方法の必要性を強調している。
その結果、慣性とディーンドラッグ力を用いて、マイクロ流体チップを介してサイズと可塑性に基づいて細胞を分離するスパイラルマイクロ流体デバイスを評価しました。マイクロ流体チップに存在するディーン渦の形成は、内壁に沿って位置するより大きなCTCと、チップの外壁に沿ってより小さな免疫細胞をもたらす。濃縮プロセスは、濃縮CTC分画として、より大きな細胞を集出口にサイフォンすることによって完了する。この方法は、特に感受性および特異的(全血の約1 CTC/mLの検出)14であり、カスタマイズされた免疫蛍光(IF)分析に関連させることができる。これらの用具は臨床解釈のための肯定的なしきい値の設定を可能にする。このように、生物学者が高い回復率と特異性を持つ免疫表現型CTCを分離し、免疫性を高めるワークフローを説明します。このプロトコルは、CTCを収集するためのスパイラルマイクロ流体デバイスの最適な使用、癌の種類に応じてカスタマイズできる最適化されたIFアッセイ、および半自動を実行するために細胞画像を測定および分析するための無料のオープンソースソフトウェアの使用について説明します。蛍光染色による細胞の数値化。さらに、顕微鏡多重化は、利用可能な蛍光フィルター/マーカーの数に応じて行うことができる。
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Protocol
サンプルは、患者の書面による同意に従ってリヨン大学病院に拠点を置くCIRCAN(「CIRculating CANcer」)コホートの枠組みの中で前向きに収集されました。この研究はCIRCAN_ALLコホートに統合された。CIRCAN_ALLの研究は、参考文献L15-188の下で2015年04月11日付けのCPP南東IVによって非介入として認識された。改訂版は、参考L16-160の下で20/09/2016に非介入として認識されました。CIRCAN_ALL研究は、参照15-131の下で、2015年01月12日にホスピス市民デリヨンのITと自由の特派員に宣言されました。血液採取は、医師が腫瘍進行の最も早い徴候を観察したときに行われた。
注:材料の表に記載されているすべての試薬と材料を、分析前のサンプル調製および免疫蛍光アッセイに対して、それぞれの保管条件と共に使用してください。試薬の置き換えや保管条件の変更は、最適でないアッセイ性能をもたらす可能性があります。
1. スパイラルマイクロ流体装置の除染
注:スパイラルマイクロ流体装置の除染は、細菌汚染から発生するすべての免疫蛍光の背景を除去し、CTCの細胞形態を探索し、正常な免疫細胞からそれらを区別することができる必要があります。このプロトコルは、血液サンプリング後6時間以内にK2 EDTAチューブで採取された血液サンプル用に最適化され、クリーンな条件下でスパイラルマイクロ流体装置を使用して濃縮されます。他のタイプのサンプル(他の生物学的流体)にこのアッセイを使用すると、追加の最適化が必要な場合があります。この除染プロトコルは週に1回行うべきです。
- 試薬の調製
- 希釈バッファーの調製
- 0.22 μmのシリンジフィルターを用いて20mLの希釈剤を殺菌し、1xリン酸バッファー生理食塩水(PBS)超純性(材料表)の1Lに直接添加します。
- 試薬と入力ストローの殺菌
- RBCリシスバッファとリサスペンションバッファ(RSB;材料の表)各溶液のための新しい50 mLポリプロピレン円錐形の管の0.22 μmのシリンジフィルターおよびストックを使用して。
- 万能洗浄試薬(材料の表)で1時間室温(RT)でインキュベートして入力ストローを殺菌する。わらを漂白剤系洗浄剤(材料の表)に移し、RTで1時間インキュベートします。
- 入力ストローを1時間の無菌PBSで2回すすいで、殺菌された入力ストローを外科的に滅菌袋(材料の表)に保管します。
- 希釈バッファーの調製
- スパイラルマイクロ流体装置の除染
- 万能洗浄試薬を用いて消毒
- 茶色のネジを外して、スパイラルマイクロ流体装置の希釈ポートから希釈ボトルキャップを取り外します。微生物学的安全キャビネットの下で、新しい空のボトルに多目的洗浄試薬(材料のテーブル)の250までのmLを移す。
- 希釈ボトルキャップとストローを、微生物学的安全キャビネットの下にある250mLの万能洗浄試薬のボトルにねじ込みます。このボトルを茶色のネジをねじ込んでスパイラルマイクロ流体装置の希釈ポートに取り付けます。
- 漂白剤の100 mLまで転送(1%最終濃度;材料の表)ランキットで供給される廃棄物コンテナに(図1A)。
- 新しい無菌入力ストローを入力ポートのらせんマイクロ流体デバイス(材料のテーブル)にロードします。入力ポートに新しい 50 mL 遠心チューブをロードします。出力ポートに新しい 50 mL 遠心チューブをロードします。
- スパイラルマイクロ流体デバイスのプライムをクリックして、スパイラルマイクロ流体デバイス(3分)をクリックして、スパイラルマイクロ流体デバイスのプライムに進みます。素数が完成したら、入力チューブを取り外します。
- 微生物安全キャビネットの下の血清学的ピペットが付いている新しい50 mL遠心管に目的のクリーニング試薬の15までのmLを移し、螺旋的なマイクロ流体装置の入力ポートに管を付ける。
- 実行を開始する前に、ソリューションに過剰なバブルが含めていることを確認してください。気泡が存在する場合は、ピペットでゆっくりと吸引でそれらを削除します。
- スパイラルマイクロ流体デバイスに除染マイクロ流体チップをロードします。スパイラルマイクロ流体デバイスでプログラム 3 を実行するには、[実行] をクリックし、プログラム 3 (31 分)を選択します。
注:スパイラルマイクロ流体デバイスのプログラム3は、31分でCTCの急速な濃縮を可能にします。 - 入力チューブ内の汎用洗浄試薬の残量を使用して、スパイラルマイクロ流体装置の洗浄ステップを続けます。
- クリーニングステップが完了した後に入力チューブを破棄し、入力ストローを残します。
- 漂白剤系洗浄剤による除染
- 茶色のネジを外して、スパイラルマイクロ流体装置の希釈ポートから汎用洗浄試薬ボトルキャップを取り外します。微生物学的安全キャビネットの下で、漂白剤系洗浄剤(材料の表)を最大250mLの新しい空のボトルに移す(図1A)。
- 汎用洗浄試薬ボトルキャップとストローを、微生物安全キャビネットの下に漂白剤系洗浄剤を含むボトルにねじ込みます。このボトルを茶色のネジをねじ込んでスパイラルマイクロ流体装置の希釈ポートに取り付けます。
- 微生物安全キャビネットの下の血清学的ピペットを使用して、新しい50 mL遠心管入力チューブに漂白剤系洗浄剤の最大15 mLを転送します。50 mL 遠心分離管入力位置をロードします。空のチューブを出力位置にロードします。
- 実行を処理する前に、サンプルに過剰な気泡が含まれ、存在する場合は、ピペットでゆっくりと泡を吸引して気泡を除去することを確認します。
- [実行]をクリックし、プログラム 3 (31 分)を選択して、プログラム 3 を実行します。実行後、入力チューブ内の漂白剤系洗浄剤の残量を用いて洗浄工程に直接進みます。
- 入力チューブと出力チューブを破棄します。
- スパイラルマイクロ流体装置をすすいでください。
- 茶色のネジを外して、漂白剤系の洗浄剤ボトルキャップをスパイラルマイクロ流体装置の希釈ポートから取り外します。微生物学的安全キャビネットの下で、漂白剤系洗浄剤を含むボトルから希釈バッファーを含む新しいボトルにストローを移します。ボトルをスパイラルマイクロ流体装置にねじ込みます。
- 微生物学的安全キャビネットの下の血清学的ピペットを使用して新しい50 mL遠心管入力管に殺菌された水(材料のテーブル)の15までのmLを移す。50 mL 遠心分離管入力位置をロードします。空のチューブを出力位置にロードします。
- 実行を処理する前に、サンプルに過剰な気泡が含まれ、存在する場合は、ピペットでゆっくりと泡を吸引して気泡を除去することを確認します。
- [実行]をクリックし、プログラム 3 (31 分)を選択して、プログラム 3 を実行します。走行後、入力管内の殺菌水の残量を用いて洗浄工程に直接進む。
- 入力チューブと出力チューブを破棄します。
- 万能洗浄試薬を用いて消毒
2. スパイラルマイクロ流体装置バクテリアフリーを維持するためのメンテナンス
注:定期的なメンテナンスは、最後のクリーニングステップ中に一日の終わりに行う必要があります。
- 微生物安全キャビネットの下の血清学的ピペットを使用して新しい50 mL遠心管に漂白剤系洗浄剤の7 mLまで移す。スパイラルマイクロ流体装置の入力ポートに漂白剤ベースのクリーニングチューブをねじ込みます。
- クリーンランを処理する前に、入力サンプルに過剰な気泡が含まれ、存在する場合は、ピペットでゆっくりと泡を吸引して気泡を取り除きます。
- スパイラルマイクロ流体デバイスでクリーンを実行します。
3. 患者の血液サンプルからのCTCの事前分析濃縮
- K2EDTA管内の血液の7.5 mLを収集し、細胞沈降や凝固を避けるために穏やかな攪拌の下で保ちます。6時間以内に処理します。
注:血液を防腐剤を含む無細胞DNA採取管に採取した場合は、処理するまで4°Cに保管する。濃縮ステップに進む前に、血液サンプル、RBCリシスバッファー、およびRBSバッファーがRTにあることを確認してください。 - 微生物学的安全キャビネットの下の血清学的ピペットを使用して新しい50 mL遠心管入力管に全血の7.5 mLまで移す。
- RTで1,600 x gで10分間遠心分離機を行い、バフィーコートを邪魔することなくピペットでプラズマ画分を収集します。最大7.5mLのPBSを直接同等の体積に加えてプラズマ分数を置き換えます。
- RBCリシスバッファー(材料表)を血液試料に30mL(K2 EDTAチューブの場合)または37.5mL(無細胞DNA採血管の場合)に静かに追加します。血液採取管10xをゆっくりと反転させ、RTで10分間インキュベートする。
注:血液サンプルは、RBCリシス中に濃い赤色に変わります。10分後に(濃い赤と不透明から)変化が見られなかった場合は、チューブ3xを穏やかに反転させ、さらに5分間放置します。サンプルの品質とアッセイ性能を損なう可能性があるため、サンプルをRBCリシスバッファに15分以上放置しないでください。 - RTで10分間500 x gで分解された血液サンプルを遠心分離し、遠心ブレーキをオン(または最高の減速速度)で行います。パスツールピペットまたは血清ピペットを使用して、体積が4-5 mLマークに達するまで上清を穏やかに除去します。次に、濾過されたマイクロピペットの先端を使用して、残りの上清を除去する。
- フィルター付き先端を備えたP1000マイクロピペットを使用して、50 mL遠心管入力チューブの壁にRSBの1.0 mLを追加します。ミックスに気泡が入らないように、サンプルが均質になるまで上下にゆっくりとピペッティングしてセルペレットを再中断します。
- 50 mL 遠心管入力チューブの壁に RSB の 3 mL を追加します (総容積 4 mL)。ミックスに気泡を導入しないようにしてください。セルサスペンションを上下に優しく混ぜてゆっくりと混ぜます。
注:通常のピペットがセルの塊を分解できない場合(ピペット先端が表示されているか、またはブロックされることによって定義される)、40 μm セルストレーナーを通してサンプルをフィルタリングして、塊を除去します。150 μL の RSB をサンプルに追加して、フィルタリングによる体積損失を補います。この方法は、大きな塊が観察された場合にのみ、控えめに使用されることに注意してください。 - 濃縮ステップに進む前に、サンプルに過剰な気泡が含まれ、存在する場合は、気泡を取り除き、サンプルを廃棄しないように注意してください。小さな気泡が存在する場合、その除去は必要ありません。
- スパイラルマイクロ流体デバイスでサンプルを処理します。
4. スパイラルマイクロ流体装置による患者全血からのCTCの濃縮
- 新しいスパイラルマイクロ流体チップをロードします。入力ポートと出力ポートに空の 50 mL 遠心チューブを 2 本取り込みます。
- スパイラルマイクロ流体デバイス(3分)でプライムをクリックしてプライムを実行します。入力チューブと出力チューブを取り外し、入力ポートで処理するサンプルをロードします。
- 出力ポートにクリア 15 mL 円錐管をロードして、充実したCTC を収集します。
- 出力チューブと遠心分離機を500 x gで10分間アンロード(加速度:9;減速:5)5mLの血清ピペットで、円錐形の15mLチューブの2mLマークで上清停止を取り除きます。マイクロピペットを使用して、円錐 15 mL チューブ上の 100 μL マークで停止する上清を取り除きます。濃縮されたサンプルを直接処理して、免疫蛍光染色を行います。
5. 免疫蛍光染色
- 血球計型グリッドを使用してチャンバ付きスライド上に列挙し、mLあたりの細胞数を列挙します。濃縮されたサンプルを0.2%の抗結合溶液(材料表)で希釈し、細胞スピン当たり100,000細胞/100μLに達する濃度に希釈します。
- 0.2%の反結合溶液の50 μLで綿(材料の表)を使用してサンプルチャンバーの輪郭を湿らせます。ポリリシンガラススライドを試料室に置き、閉じます。
- 上下3倍のピペッティングで0.2%アンチバインディング溶液で先端をコーティングします。濃縮されたサンプルを再中断し、細胞溶液をサンプルチャンバに移します。400 rpmで専用の遠心分離機(材料のテーブル)を持つ遠心分離機は4分間(加速低い)。
- 堆積の領域の周りにシリコンアイソレータを配置します。微生物学的安全キャビネットの下でガラススライドを2分間乾燥させます。
- 無菌PBSの3 mLで16%パラホルムアルデヒド(PFA)の1mLを希釈することにより、固定液を調付します。サンプルあたり100 μLの固定液(4%PFA)を追加し、RTで10分間インキュベートし、固定液を取り除き、200 μLのPBSで3回の洗い出しを行い、それぞれ2分間RTでインキュベートします。
注意:吸入を防ぐために化学安全キャビネットの下でPFAを使用してください。 - 胎児ウシ血清(FBS)を5%で希釈し、Fc受容体(FcR)遮断試薬を5%、ウシ血清アルブミン(BSA)を無菌PBS(材料表)で1%で希釈して飽和液を調出す。サンプル1サンプルあたり100μLの飽和溶液を追加し、RTで30分間インキュベートします。
- サンプルあたり100 μLの抗体溶液を添加する(CD45抗体1/20;PanCK抗体 1/500;PD-L1抗体 1/200;Qsp飽和液 100 μL) (材料の表)ポリリシンガラススライドを100mm x 15mmのペトリ皿に入れます。無菌水の2 mLで吸収性紙を湿らせ、蓋でペトリ皿を閉じます。一晩4°Cに置き、光から保護します。
- 抗体ミックスを取り除き、200μLのPBSで3回の洗浄を行い、各洗浄を2分間インキュベートします。サンプルを5分間乾燥させ、光から保護します。堆積の領域に取り付け液(材料のテーブル)の10 μLを配置し、気泡を作ることなく顕微鏡カバースリップでカバーします。カバースリップをマニキュアで密封します。
6. ストレート蛍光顕微鏡と関連ソフトウェアによる免疫蛍光画像の取得
- X/Y電動プラットフォームを備えたストレート蛍光顕微鏡を使用してください。DNA色素(4',6-diamidino-2-フェニリンドール[DAPI])、PanCK色素(フルオレセインイソチオシアネート[FITC])、PD-L1色素(CY3)、CD45色素(CY5)に対応する4つのチャンネルで8ビットRGBティフ画像を撮影する目的を20倍の目的で使用します。使用前に水銀灯を15分オンにし、顕微鏡と関連ソフトウェアを半自動撮影に合わせます。
- ガラススライドをプラットフォームに置きます。
- 取得メニューで、4つのチャンネルを定義し、露光時間を設定します(DAPI:15ミリ秒、FITC[PanCK]:500ミリ秒)CY3 [PD-L1]: 800 ミリ秒;CY5 [CD45]: 1,000 ミリ秒)スキャンするタイルを定義します。[タイル] をクリックします。高度な実験では、スキャンする領域を定義します。
- 画面のフォーカスを調整します。[実験の開始]をクリックします。
- 各チャネルの TIF ファイルをエクスポートし、この情報を使用してイメージ ファイルに具体的に名前を付けます: Sample_NumberofTilesRegion_dye_NumberOfSubtiles.tif (Sample1_TR1_c1m01)。DAPI チャネルは c1、FITC チャネルは c2、CY3 チャネルは c3、CY5 チャネルは c4 です。
7. 画像解析ソフトウェアを使用した免疫蛍光画像の解析
- ブロード研究所のウェブサイトから無料の画像解析ソフトウェアをダウンロードしてインストールします。インストール中にすべての既定値を受け入れます。画像解析ソフトウェアを開き、[ファイル] をクリックします |ファイルからのパイプライン|分析_4チャネル_CTC.cppipe.
注:パイプラインは、RGB カラー イメージをグレースケールに変換し、中央値フィルターで画像をスムージングしてアーティファクトを削除し、核と細胞質を識別し、各チャネルの蛍光強度を定量化し、Excel ファイルにエクスポートします。 - ファイルリストにファイルをドロップします。メタデータを更新して、タイルでファイルをグループ化します。
注:イメージをグループ化するすべての手順は、ソフトウェアで指定されています。NameAndTypesモジュールに名前ファイルが表示され、ファイルはサンプルごとのタイル数とチャネル数に従ってグループ化されます。 - [出力設定を表示] をクリックし、正しい既定の出力を指定します。[画像の分析] をクリックします。メジャー強度パラメータに対応するスプレッドシートファイルを開きます。
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Representative Results
最初の前提条件は、組織培養のための汚染されていない(感染性薬剤を含まない)CTCのコレクションを取得し、IFの背景が生成されないようにすることです。除染プロトコルは、すべてのパイプとポンプの洗浄を可能にし、細菌汚染なしで良好な回収率でCTCの収集をもたらした。濃縮されたサンプルは、スパイラルマイクロ流体装置の除染プロトコルワークフローの有無と比較した。除染プロトコルを検証するために、A549細胞株は全血がない場合に使用され、らせん状のマイクロ流体装置を使用して直接濃縮された。最適化された除染プロトコルがなければ、わずか24時間後に濃縮されたA549細胞株の組織培養において高い細菌汚染が認められ、真核細胞の死亡および細胞形態変化を引き起こした(図1B)。
これに対し、洗浄プロトコルの後、生体A549細胞は、組織培養および培養の10時間後および3D条件(図1B)、ならびに患者サンプル(図1C)の後に2D培養で増殖することによって得られた。潜在的な CTC は赤い十字で識別されます (図 1C)。
図2は、全血から濃縮されたCTCの免疫蛍光表現型の完全なワークフローを要約する。全血サンプリング、CTC濃縮、免疫蛍光(IF)アッセイ、ソフトウェアを用いた画像解析の4つの主要ステップで構成されています。以前は、スパイラルマイクロ流体デバイスの回収率は14に対処されている。蛍光模倣CTC(mCTC)を用いて、この回収率は1.3 CTC/mL全血14で確立された。
本研究では、濃縮CTCと下流可視化のIF解析に最適な条件を設定することに焦点を当てた(図2)。まず、PD-L1抗体の特異性を試験するために、(1)PC3高陽性PD-L1細胞株と(2)SW620低陽性PD-L1細胞株の2つの細胞株を用いた。その後、細胞をスパイラルマイクロ流体装置で濃縮し、IFにより分析した。全ての細胞を腫瘍抗PanCKマーカー、白血球抗CD45マーカー、抗PD-L1(肺癌に有用)、およびDAPI(核色素)で染色した。白血球はDAPIとCD45で陽性と同定され,癌細胞はDAPIとPanCKに対して陽性,CD45では陰性と同定された.PC3高PD-L1陽性細胞株はPD-L1に対して陽性染色され,SW620低PD-L1陰性細胞株では低いPD-L1発現が検出された.
次いで、(i)液体IF染色アッセイ、(ii)CTCの染色をポリリシン被覆スライドに直接堆積させ、(iii)ポリリシン被覆スライド上のサイトスピン後のCTCのIF染色を比較した。CTCの回収率は、使用するプロトコルの種類に依存していることが明らかに観察された(図3A)。液体IF染色アッセイにおいて、スパイクmCTCの数に対する回収率はわずか10%であった。この低い回復率は転移性NSCLCのほとんどの患者にとって問題を提示し、これらのテストの能力を著しく制限して、少数のCTCを分離し、表現力学的情報を提供する。記載された第2および第3のセクション(細胞質を含まないポリリシン被覆スライドにmCTCまたはCTCを直接堆積させる)は、系統的に60%を超える回収率を有していた(図3A)。
図 3Bは、同じ患者からの全血サンプルを用いてこれらのIFアッセイの代表的な画像を示し、液体IF染色アッセイまたはサイトスピンを用いたポリリシン被覆スライド上のIF染色アッセイを用いた。核の列挙は、2つのアッセイの間で明らかに異なっていた(図3B)。核DAPI染色は、サンプル中の全細胞の列挙を提供し、バイオマーカー染色は、PANCK陽性細胞の緑色、PD-L1陽性細胞中のオレンジ色、CD45残留白色細胞中の赤色のハイライトを可能にしました(図3)B)。
次に、白血球を腫瘍細胞から細胞学的に分化させるには、細胞型の特徴であるため、核の形状を可視化する必要がある。図 3Cは、サイトスピンステップが存在しない場合に異常であるぼやけ性および形態である核の輪郭を示す。このように最適化されたプロトコルには、ポリリシンコーティングされたスライド上の濃縮CTCのサイトスピニング、続いて4%パラホルムアルデヒド(PFA)固定が含まれ、IF染色前にスライドを保存する。この最適化されたプロトコルは、非常に少数の細胞が添加された場合でも、ポリリシンコーティングされたスライド(図3A)にmCTCを直接堆積させるのと同様の回復率を持っていた。この追加のステップは核形態の保存を可能にするので(図3C)、顆粒球は、その多重核と、腫瘍細胞(核内の赤十字で標識された)と核で同定された。白血球に比べて異常、悪性腫瘍パターン、大きさが大きい。
IFプロトコルの最適化後、転移性患者からの全血を用いて概念実証を行った。サンプルは、リヨン大学病院に拠点を置くCIRCANルーチンコホートの枠組みの中で、前向きに収集されました。血液採取は通常、医師が腫瘍進行の最も早い徴候を観察したときに行われた。すべての腫瘍症例は、最初の診断時にFFPE生検で組織学的または細胞学的に確認された。ここでは、進行時のCTC分析は、臨床データへのアクセスまたは事前の知識を持たない研究者によって行われた。詳細な事前分析に関する考慮事項は、以前に15に公開されています。
図4、表1、および表2では、患者サンプルから異なる所見が提示される。CD45(+)、PanCK(-)、PD-L1(-)プロファイルは免疫細胞を表す。白血球の残留数は強く変動し、全血試料に依存することが示された。この小型パイロットコホートの範囲は648-11,000白いCD45(+)細胞でした(図5A)。その結果、CTC濃縮直後に、集めた細胞の列挙を含め、100,000細胞/サイトスピンの密度で細胞スピン領域の細胞密度を調整した(セクション6参照)。これにより、患者1人あたり数のサイトスピンの性能と、手動列挙および画像解析ソフトウェアパイプラインの使用のための顕微鏡観察の最適化が可能になりました。
図4A-C、表1、表2では、残留白血球数が大きく異なる典型的な症例が報告されている。
(i) 最初のプロファイルは、図4Aに示す CD45(-)、PanCK(+)、および PD-L1(+) です。多くの場合、細胞の大きさは直径13μmよりも優れ、核形態は不規則であり、悪性腫瘍の細胞形態パターンを表す。この集団はCTCで構成されている可能性が高い。
(ii) 2 番目のプロファイルは CD45(-)、PanCK(-)、および PD-L1(+)です。既に報告されているように、すべてのCTCがPanCKバイオマーカーを発現しているわけではありません(図4A)。
(iii) 3 番目のプロファイルは CD45(-)、PanCK(+)、および PD-L1(-)です。既に報告されているように、すべてのCTCがPD-L1バイオマーカーを発現しているわけではありません。
(iv) 4 番目のプロファイルは、図4Bに示す CD45(+)、PanCK(+)、および PD-L1(+) です。これは、患者全血中の非定型活性化免疫細胞を表す。この集団は、いくつかの出版物16、17、18に記載されており、濃縮後の全細胞の約5%を表す。この集団の存在は、CD45信号の強度が低すぎると核の形態が十分に保存されていない場合、サンプル中の偽陽性CTCの速度を増加させる可能性があります。これは、この免疫蛍光アッセイにおいて、ビメンチンおよび/またはEpcamのような相補的な腫瘍バイオマーカー染色を行う必要性を強く強調する。
(v) 最後に、最後のプロファイルには、図 4Cで強調表示されているラベルなしセル CD45(-)、PanCK(-)、および PD-L1(-)が含まれます。この集団の核は悪性腫瘍の細胞形態パターンを示すことが多く、その大きさは直径13μmを超える。サンプル中のこれらの細胞の割合は、患者の全血に応じて非常に変動する。これは、この細胞サブ集団の腫瘍パターンを確認するために相補的な腫瘍バイオマーカーを使用する必要性を強調する。
表1および表2では、高度な転移性NSCLC患者から16サンプルの細胞数を報告した。細胞をバイオマーカーの発現に従って分類した。得られた亜集団では高い変動性が認められた。独立した研究で既に報告されているように、CD45(-)、PanCK(+)、およびPD-L1(+)プロファイルは、ほとんどのサンプルで見つかりました。それにもかかわらず、CTC集団は非常に不均一であり、患者サンプルにはCD45(-)、PanCK(-)およびPD-L1(+)サブ集団、CD45(-)、およびPD-L1(-)サブ集団および非標識細胞CD45(-)、PanCK(-)およびPD-L1(-)も含まれていた。サブ母集団。残留白血球のレベルは、分析されたサンプルの中で非常に変動した。
細胞列挙を容易にするために、免疫蛍光画像の自動分析のための画像解析ソフトウェアを使用してパイロットパイプラインを設定しました。ワークフローについて説明しますが、図 5を参照してください。この場合、コントラストおよび蛍光強度の点で高品質の免疫蛍光画像を取得することが重要である。ハードウェアのクラスター計算の容量に応じて、画像解析パイプラインは、サイトスピンの完全なマージされたイメージまたはサイトスピンの代表領域に適用できます。
ここで、顕微鏡に基づいて、サイトスピンの半自動スキャン(X/Y;Zフォーカスは含まれていない)領域は150〜200のマージされた画像を生成した。これらのイメージは、画像分析パイプラインを使用してマージし、直接分析できます。それにもかかわらず、この手順は時間と計算クラスターのリソースを消費し、実験室での日常的な使用のための重要な制限です。そこで、細胞血液学の分野での経験をもとに、細胞の分布が細胞紡の全領域で均質であることを顕微鏡で検証した上で、各サンプルの代表的な領域を分析することにした。次に、サイトスピンの総面積の25%(約40タイル)を蛍花顕微鏡でスキャンし、40x4の独立した画像を生成した。マージされたファイルはチャネルによって分割され、画像ファイルは顕微鏡ソフトウェアで自動的に生成されました(セクション7を参照)。図 5A.これらのファイルは、説明されたパラメータに従って分析用の画像解析パイプラインにインポートされました (セクション 8 を参照してください。図 5A)。
図5Bでは、77個の免疫細胞[CD45(+)]、PanCK(-)、およびPD-L1(-))の4つのCTC(CD45(-))、PD-L1(+))を表示する代表的な画像を手動で特定しました。図 5Bは、画像解析ソフトウェアがDAPI染色に基づいて細胞数を同定し列挙する方法を示す。また、画像解析ソフトウェアがセカンダリ オブジェクトをカウントする方法も示します。最後に、画像で報告されたすべての物体について、各蛍光チャネルの蛍光強度が報告された。
背景は、サンプル中に存在する負の細胞によって計算され、表された。例えば、非活性化免疫細胞は蛍光強度が低く、PanCKおよびPD-L1染色の背景の測定が可能である。蛍光シグナルは、蛍光強度が背景の2倍を超えた場合(4つの独立した患者サンプルの分析に基づく)陽性とみなされた。CD45染色に関しては、CD45の発現レベルが白血球サブ集団において非常に変動するように、陽性の閾値を可能な限り低く設定した。CD45抗体で染色された10の健康な全血の画像の分析に基づいていた。パイロット解析(n= 4)は、手動列挙と画像解析ソフトウェア列挙の一致を示した(表2)。サイトスピン上の各細胞は画像解析ソフトウェアによって識別され、生物学者は細胞を追跡し、必要に応じて手動で結果を確認することができます。
図 1: 除染のワークフローの概要スパイラルマイクロ流体デバイス楽器。(A) 除染プロセスに含まれる3つの主要なステップ(プロトコルを参照)、機器の入出力の局在化を示す。(B) 器械の除染前後のA549細胞ライン濃縮の代表的な画像。集められた細胞の生存率および形態に対する感染剤の存在の影響が示される。細菌の存在下で、細胞形態および生存率が修飾された。スケールバー = 20 μm. (C) 肺、前立腺および乳癌の濃縮患者サンプルの3D細胞培養。赤十字は非定型細胞に対応します。スケールバー = 20 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 全血中採取から蛍光画像の解析までの免疫蛍光分析のワークフローの概要主なステップは、全血の血液採取、スパイラルマイクロ流体装置を用いてCTCコレクション、免疫蛍光アッセイ、画像解析ソフトウェアです。バイオマーカーの選択は、サイトスピンスライド上で観察可能な細胞の様々な集団のより良い同定によって駆動された(免疫細胞のためのCD45、肺癌細胞のためのPanCKおよびPD-L1)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:3つの独立した染色プロトコルの回収率。(A) 液体染色によるmCTの回収率の比較、ポリリシン被覆スライドに堆積した細胞の直接染色、ポリリシン被覆スライド上の細胞スピン後の細胞染色(B)細胞スピンステップを用いて液体IFプロトコルおよび直接免疫染色プロトコルによって処理された患者サンプルの代表的な画像。細胞をCD45モノクローナル抗体(クローンHI30)アレクサフルオール647で染色した。PanCKモノクローナル抗体(クローンAE1/AE3)アレクサフルオール488;4',6-ダイアミディーノ-2-フェニリンドール(DAPI)。スケールバー = 20 μm. (C) 細胞スピンステップの有無にかかわらず細胞濃縮のDAPI染色の代表的な画像。核の形態および大きさは、DAPI染色を用いて示された。赤十字は、右側の画像の核に異常を持つ細胞を強調表示します。左側のイメージでは、セルが同じレベル (X 軸、Y 軸、および Z 軸) にないため、イメージはあいまいです。スケールバー = 10 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: セル プロファイルの識別 。(A) 異なるCTCプロファイルを有する患者の代表的な画像。蛍光チャネルは別々に提示される。マージされたイメージが左側に表示されます。それらはCD45モノクローナル抗体(クローンHI30)アレクサフルオール647で染色されています。PanCKモノクローナル抗体(クローンAE1/AE3)アレクサフルオール488;PDL-1モノクローナル抗体(クローン29E2A3)フィコエリスリン;4',6-ダイアミディーノ-2-フェニリンドール(DAPI);矢印は非定型セルを指します。(B)非定型白血球プロファイルを持つ2つの患者サンプルの免疫染色の代表的な画像。細胞をCD45モノクローナル抗体(クローンHI30)アレクサフルオール647で染色した。PanCKモノクローナル抗体(クローンAE1/AE3)アレクサフルオール488;PDL-1モノクローナル抗体(クローン29E2A3)フィコエリスリン;4',6-ダイアミディーノ-2-フェニリンドール(DAPI)。画像は、CD45(+)、PanCK(+)、およびPD-L1(+)で染色された免疫細胞の存在を強調しています。(C) 画像は、ラベルなしセル (CD45(-))、PanCK(-)、および PD-L1(-)) の存在を強調表示します。スケールバー = 10 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 蛍光画像の解析の概要(A) 主な手順として、顕微鏡検査スキャン、蛍光に応じてチャネル分割、画像解析ソフトウェアへのファイルのインポートを行います。(B) 画像解析ソフトウェアのワークフローに関する3つの異なるステップの説明。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表1:患者細胞濃縮の手動列挙。DAPI 染色に基づく細胞の列挙。FITC、PEおよびCY5染色に基づく他のオブジェクトの列挙。
表 2:画像解析ソフトウェア患者細胞濃縮の列挙.DAPI 染色に基づく細胞の列挙。FITC、PEおよびCY5染色に基づく他のオブジェクトの列挙。手動カウントと画像解析ソフトウェアの列挙の比較。
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Discussion
本研究では、臨床応用への移植ワークフローの性能に関する2つの大きなポイント、第1の点は、得られた蛍光画像の分析のための主観性の低下に関する2つである。
CTC列挙のための実行可能で最適化されたワークフローは、CTCラベルフリーマイクロ流体システム(スパイラルマイクロ流体デバイス)を介した細胞濃縮後のカスタマイズ可能なIFアッセイを用いて最初に決定されました。このワークフローを使用して、パイロット研究は、転移性NSCLC患者からのすべてのサンプルが非定型細胞を含んでいたことを確認しました, これは、すべてのCD45(-).彼らは代わりにPanCKおよび/またはPD-L1バイオマーカーで標識されてもよい。しかし、S19サンプル(表2)で観察されるすべての試験されたバイオマーカー[CD45(-)]、PanCK(-)、およびPD-L1(-))についても完全に陰性である可能性があります。これは、CTCサブ集団を表現するための追加のバイオマーカーの必要性を強く強調しています。その結果、EpCAM、ビメンチン、N-カドヘリンなどの上皮間葉系バイオマーカーを添加することが提案されている。CD44およびCD133を含む癌幹細胞のマーカー;肺腺癌に対するTTF1を含む特定の腫瘍マーカー。
パイロット研究では、非定型細胞の範囲は全血3.5mLから[40;>400]であった。患者サンプルの80%について、非定型細胞数は50を超えていた。確かに、細胞学的19、20、21サンプルの遠藤気管支超音波ガイドトランス気管支針吸引またはCT誘導経胸腔穿刺から、PD-L1分析は、ほとんどのサンプルに適していますが、≥100腫瘍細胞の閾値は、一般的に値の統計的および臨床的解釈を生成することが認められます。しかしながら、血液CTCの特定の場合において、空間腫瘍の不均一性の問題は、小さなオンサイト腫瘍試料とは対照的にバイパスされることに留意されたい。
第2のポイントは、免疫蛍光画像の解析に対するハンドラの影響を回避することでした。このように蛍光画像の画像解析ソフトウェアは、細胞列挙を標準化し、これらのサンプルに統計データを提供するように設定された。この自動化されたプロセスは、同じサンプルに含まれるすべてのセルの分析のための強力な計算クラスターの必要性を強調しました。さらに、IF染色の品質は同じ平面内にある必要があり(共焦点システムの使用を避けるために)、サイトスピン上の細胞の密度を校正して、画像解析ソフトウェアがスライド上のすべての細胞を個別に認識できるようにする必要があります。最後に、患者のコホートにおける臨床結果に関する結果は検証されなかったが、この点は別の専用研究で取り上げるべきである。
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Disclosures
ジャン=フィリップ・オーレルとキャサリン・ウェイキ・リーは、この記事で使用される楽器を生産するバイオリディックス社の従業員です。他の著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、アストラゼネカ(ロンドン、イギリス)、バイオリディックス(シンガポール)、リーグ・コントル・ル・ガン(フランス・ローレ)からの研究助成金によって支えられた。著者らは、アストラゼネカとバイオリディクスの企業の財政的支援に感謝している。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4 °C |
| BD Facs Clean – 5 L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4 °C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4 °C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4 °C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4 °C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4 °C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone - 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4 °C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4 °C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4 °C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4 °C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4 °C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4 °C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4 °C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
References
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