Una pipeline completa per l'isolamento e la sequenza dei microRNA e la loro analisi tramite gli strumenti open source
Summary
In questo articolo viene descritta una strategia dettagliata per l’isolamento di piccoli RNA, l’arricchimento dei microRNA e la preparazione di campioni per il sequenziamento ad alto valore di velocità effettiva. Viene quindi descritto come elaborare le letture di sequenza e allinearle ai microRNA, utilizzando strumenti open source.
Abstract
La metà di tutte le trascrizioni umane sono pensati per essere regolati da microRNA. Pertanto, la quantificazione dell’espressione di microRNA può rivelare i meccanismi sottostanti negli stati della malattia e fornire obiettivi terapeutici e biomarcatori. Qui, dettagliamo come quantificare con precisione i microRNA. In breve, questo metodo descrive i microRNA isolanti, legandoli agli adattatori adatti per il sequenziamento ad alta velocità, amplificando i prodotti finali e preparando una libreria di esempio. Quindi, spieghiamo come allineare le letture di sequenziamento ottenute alle forcine a microRNA e quantificare, normalizzare e calcolare la loro espressione differenziale. Versatile e robusto, questo flusso di lavoro sperimentale combinato e analisi bioinformatica consente agli utenti di iniziare con l’estrazione dei tessuti e finire con la quantificazione dei microRNA.
Introduction
Scoperto per la prima volta nel 19931, si stima che quasi 2000 microRNA siano presenti nel genoma umano2. I microRNA sono piccoli RNA non codificanti che sono in genere lunghi 21-24 nucleotidi. Sono regolatori post-trascrizione dell’espressione genica, spesso legandosi a siti complementari nella regione 3-non tradotta (3-UTR) di geni bersaglio per reprimere l’espressione proteica e degradare l’mRNA. La quantificazione dei microRNA può fornire informazioni preziose sull’espressione genica e sono stati sviluppati diversi protocolli a questo scopo3.
Abbiamo sviluppato un protocollo definito, riproducibile e di lunga data per il sequenziamento di piccoli RNA, e per l’analisi delle letture normalizzate utilizzando strumenti bioinformatici open source. È importante sottolineare che il nostro protocollo consente l’identificazione simultanea di microRNA endogeni e costrutti esogenamente erogati che producono specie simili a microRNA, riducendo al minimo le letture che mappano ad altre piccole specie di RNA, tra cui RNA ribosomici ( rRNA), trasferire RNA piccoli (tsRNA) derivati dall’RNA), piccoli RNA derivati da rRNA e prodotti per la degradazione dell’mRNA. Fortunatamente, i microRNA sono 5-phosphollated e 2-3 idrossilato4, una caratteristica che può essere sfruttata per separarli da questi altri piccoli RNA e prodotti di degradazione mRNA. Esistono diverse opzioni commerciali per la clonazione e il sequenziamento di microRNA che sono spesso più veloci e facili da multinox; tuttavia, la natura proprietaria dei reagenti kit e le loro frequenti modifiche rendono difficile confrontare le corse dei campioni. La nostra strategia ottimizza la raccolta solo delle dimensioni corrette dei microRNA attraverso passaggi di purificazione del gel di acrilammide e agarose. In questo protocollo viene descritta anche una procedura per allineare le letture di sequenza ai microRNA utilizzando strumenti open source. Questa serie di istruzioni sarà particolarmente utile per gli utenti di informatica alle prime armi, indipendentemente dal fatto che venga utilizzato il nostro metodo di preparazione della libreria o un metodo commerciale.
Questo protocollo è stato utilizzato in diversi studi pubblicati. Ad esempio, è stato utilizzato per identificare il meccanismo con cui l’enzima Dicer fende piccoli RNA a una distanza di due nucleotidi dal ciclo interno della struttura stelo-loop – la cosiddetta “regola di conteggio del ciclo”5. Abbiamo anche seguito questi metodi per identificare l’abbondanza relativa di RNA piccoli forno (shRNA) consegnati da vettori virali ricombinanti associati ad eno-associati (RAAV), per identificare la soglia di espressione shRNA che può essere tollerata prima del fegato tossicità associata all’espressione shRNA in eccesso6. Utilizzando questo protocollo, abbiamo anche identificato microRNA nel fegato che rispondono all’assenza di microRNA-122 – un microRNA epatico altamente espresso – caratterizzando anche il modello di degradazione di questo microRNA7. Poiché abbiamo usato il nostro protocollo in modo coerente in numerosi esperimenti, siamo stati in grado di osservare i preparativi campione longitudinalmente, e vedere che non ci sono effetti batch distinguibili.
Condividendo questo protocollo, il nostro obiettivo è quello di consentire agli utenti di generare una quantificazione di alta qualità e riproducibile di microRNA praticamente in qualsiasi linea di tessuti o cellule, utilizzando attrezzature e reagenti a prezzi accessibili e strumenti di bioinformatica gratuiti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nonostante l’identificazione di microRNA oltre 20 anni fa13, il processo di sequenziamento dei microRNA rimane laborioso e richiede attrezzature specializzate, impedendo ai laboratori di adottare regolarmente protocolli interni14. Altre tecniche possono valutare simultaneamente microRNA, come microarray di microRNA e pannelli di espressione multiplexed; tuttavia, questi approcci sono limitati in quanto quantificano solo i microRNA presenti nel loro set di sonde. Per questo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri dei laboratori di Andrew Fire e Mark Kay per la guida e i suggerimenti.
Materials
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | NEB | M0242S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
References
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