Здесь мы описываем пошаговую стратегию изоляции малых РНК, обогащения микроРНК и подготовки образцов для секвенирования высокой пропускной способности. Затем мы описываем, как обрабатывать последовательность читает и выравнивать их к микроРНК, используя инструменты с открытым исходным кодом.
Половина всех человеческих стенограмм, как полагают, регулируется микроРНК. Таким образом, количественные выражения микроРНК может выявить основные механизмы в состоянии болезни и обеспечить терапевтические цели и биомаркеры. Здесь мы подробно описываем, как точно количественно осмотреть микроРНК. Вкратце, этот метод описывает изоляцию микроРНК, привязывая их к адаптерам, пригодным для секвенирования высокой пропускной способности, усилению конечных продуктов и подготовке библиотеки образцов. Затем мы объясняем, как выровнять полученные считывания последовательности с микроРНК шпильками, а также количественно, нормализовать и вычислить их дифференциальную экспрессию. Универсальный и надежный, этот комбинированный экспериментальный рабочий процесс и биоинформатический анализ позволяет пользователям начать с извлечения тканей и закончить с количественной микроРНК.
Впервые обнаружен в 1993году 1, в настоящее время оценивается, что почти 2000 микроРНК присутствуют в геноме человека2. МикроРНК представляют небольшие некодивающие РНК, которые, как правило, 21-24 нуклеотидов в длину. Они являются посттранскрипционными регуляторами экспрессии генов, часто связывающимися с дополнительными участками в 3-непереведенном регионе (3-UTR) генов-мишеней для подавления экспрессии белка и деградации мРНК. Количественная микроРНК может дать ценную информацию о экспрессии генов и несколько протоколов были разработаны для этой цели3.
Мы разработали определенный, воспроизводимый и давний протокол для мелкого секвенирования РНК, а также для анализа нормализованных считываний с использованием инструментов биоинформатики с открытым исходным кодом. Важно отметить, что наш протокол позволяет одновременно идентифицировать как эндогенные микроРНК, так и экзогенно доставленные конструкции, которые производят микроРНК-подобные виды, при этом минимизируя считывая эту карту другим малым видам РНК, включая рибосомные РНК ( РНК), передачи РНК-производных малых РНК (tsRNAs), повторных полученных малых РНК, и мРНК продуктов деградации. К счастью, микроРНК 5-фосфорилированных и 2-3 гидроксилированных4, функция, которая может быть использована, чтобы отделить их от этих других небольших РНК и мРНК продуктов деградации. Существует несколько коммерческих вариантов клонирования и секвенирования микроРНК, которые зачастую быстрее и проще в мультиплексе; однако, запатентованные характер реагентов комплекта и их частые изменения делают сравнение проб работает сложной задачей. Наша стратегия оптимизирует сбор только правильный размер микроРНК с помощью акриламида и шагов по очищению агарозного геля. В этом протоколе мы также описываем процедуру выравнивания последовательности считывается на микроРНК с помощью инструментов с открытым исходным кодом. Этот набор инструкций будет особенно полезен для начинающих пользователей информатики, независимо от того, используется наш метод подготовки библиотеки или коммерческий метод.
Этот протокол был использован в нескольких опубликованных исследованиях. Например, он использовался для определения механизма, с помощью которого фермент Dicer расщепляет небольшие ШПильки РНК на расстоянии двух нуклеотидов от внутренней петли структуры стволовой петли – так называемого “правила подсчета петли”5. Мы также следовали этим методам, чтобы определить относительное изобилие доставленных небольших РНК шпильки (SHRNA), выраженных от рекомбинантных адено-ассоциированных вирусных векторов (rAAVs), чтобы определить порог экспрессии shRNA, которые могут быть переновлены до печени токсичность, связанная с избыточным выражением shRNA6. Используя этот протокол, мы также определили микроРНК в печени, которые реагируют на отсутствие микроРНК-122 – высоко выраженной печеночной микроРНК – в то же время характеризуя узор деградации этой микроРНК7. Поскольку мы последовательно использовали наш протокол в многочисленных экспериментах, мы смогли наблюдать за пробными препаратами продольно и видеть, что нет заметных эффектов партии.
При совместном использовании этого протокола, наша цель заключается в том, чтобы позволить пользователям генерировать высокое качество, воспроизводимую количественную оценку микроРНК практически в любой ткани или клеточной линии, используя доступное оборудование и реагенты, а также бесплатные инструменты биоинформатики.
Несмотря на выявление микроРНК более 20 лет назад13, процесс секвенирования микроРНК остается трудоемким и требует специализированного оборудования, препятствуя лабораториям от регулярного принятия внутренних протоколов14. Другие методы могут одновременно о?…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить сотрудников лабораторий Эндрю Файр и Марка Кей за рекомендации и предложения.
100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
HCl | Sigma | 320331 | |
KOH | Sigma | P5958 | |
Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
T4 RNA Ligase 2, truncated | NEB | M0242S | |
TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
TEMED | Biorad | 161-0800 | |
Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
Urea | Sigma | U5378 |