MicroRNAs를 격리하고 시퀀싱하고 오픈 소스 도구를 사용하여 분석하기 위한 완벽한 파이프라인
Summary
여기서는 작은 RNA를 격리하고, microRNAs를 보강하고, 처리량이 높은 시퀀싱을 위한 샘플을 준비하기 위한 단계별 전략을 설명합니다. 그런 다음 시퀀스 읽기를 처리하고 오픈 소스 도구를 사용하여 microRNAs에 정렬하는 방법을 설명합니다.
Abstract
모든 인간 적인 전사체의 반은 microRNAs에 의해 통제되기 위하여 생각됩니다. 따라서 microRNA 발현을 정량화하면 질병 상태의 기본 메커니즘을 밝히고 치료 대상 및 바이오마커를 제공할 수 있습니다. 여기서는 마이크로RNA를 정확하게 정량화하는 방법을 자세히 설명합니다. 간단히 말해서, 이 방법은 microRNAs를 분리하고, 고처리량 시퀀싱에 적합한 어댑터에 합착하고, 최종 제품을 증폭하고, 샘플 라이브러리를 준비하는 방법을 설명합니다. 이어서, 얻어진 시퀀싱 읽기를 마이크로RNA 헤어핀에 정렬하고, 정량화, 정규화 및 차등 발현을 계산하는 방법을 설명한다. 다재다능하고 견고한 이 결합된 실험 워크플로우와 생물정보학 분석을 통해 사용자는 조직 추출을 시작하고 microRNA 정량화로 마무리할 수 있습니다.
Introduction
1993년에 처음발견된 1, 현재 거의 2000개의 마이크로RNA가 인간 게놈2에존재하는 것으로 추정된다. MicroRNAs는 전형적으로 21-24 뉴클레오티드 긴 작은 비코딩 RNA입니다. 그(것)들은 단백질 발현을 억압하고 mRNA를 저하시키기 위하여 표적 유전자의 3-번역되지 않은 지역 (3-UTR)에 있는 상보적인 사이트에 수시로 결합하는 유전자 발현의 사후 전사 조절자입니다. 마이크로RNA를 정량화하면 유전자 발현에 대한 귀중한 통찰력을 제공할수 있으며 이 목적을 위해 여러 프로토콜이 개발되었습니다 3.
당사는 작은 RNA 시퀀싱을 위한 정의되고 재현 가능하며 오래 지속되는 프로토콜을 개발했으며, 오픈 소스 생물정보학 도구를 사용하여 정규화된 판독을 분석했습니다. 중요한 것은, 우리의 프로토콜은 내인성 microRNAs와 외인성 으로 마이크로RNA 와 같은 종을 생성하는 생성물 모두를 동시에 식별할 수 있게 하는 동시에, 리보솜 RNA를 포함한 다른 작은 RNA 종에 대한 지도를 최소화하는 동시에 ( rRNA), RNA 유래 작은 RNA(tsRNAs), 반복 유래 작은 RNA 및 mRNA 분해 산물을 전달한다. 다행히, microRNAs는 5-인산화 및 2-3 하이드록시레이트4,이러한 다른 작은 RNA 및 mRNA 분해 산물로부터 이들을 분리하는 데 활용할 수 있는 특징이다. 종종 멀티플렉스에 더 빠르고 쉽게 마이크로RNA 복제 및 시퀀싱을 위한 몇몇 상업적인 선택권존재; 그러나 키트 시약의 독점적 특성과 빈번한 수정으로 인해 샘플 실행을 비교하기가 어렵습니다. 우리의 전략은 아크릴아미드와 아가로즈 젤 정제 단계를 통해 정확한 크기의 마이크로RNA만 수집을 최적화합니다. 이 프로토콜에서는 오픈 소스 도구를 사용하여 시퀀스 읽기를 microRNAs에 정렬하는 절차도 설명합니다. 이 지침 세트는 라이브러리 준비 방법또는 상용 방법이 사용되는지 여부에 관계없이 초보자 정보학 사용자에게 특히 유용합니다.
이 프로토콜은 여러 출판 된 연구에서 사용 되었습니다. 예를 들어, Dicer 효소가 줄기 루프 구조의 내부 루프로부터 2개의 뉴클레오티드의 거리에서 작은 헤어핀 RNA를 절단하는 메커니즘을 식별하기 위해사용되었다 – 소위 “루프 카운팅 규칙”5. 우리는 또한 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터 (rAAv)에서 발현된 전달된 작은 머리핀 RNAs (shRNA)의 상대적인 풍부를 확인하기 위하여 이 방법을 따랐습니다, 간 이전에 용납될 수 있는 shRNA 발현의 임계값을 확인하기 위하여 과잉 shRNA 발현과 관련된 독성6. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 또한 microRNA-122의 부재에 반응하는 간에서 microRNA를 확인했습니다 – 고도로 발현된 간microRNA – 또한 이 microRNA 7의 분해 패턴을 특성화하는 동안. 우리는 수많은 실험에서 우리의 프로토콜을 일관되게 사용했기 때문에, 우리는 종로적으로 견본 준비를 관찰하고, 확인할 수 있는 배치 효력이 없다는 것을 볼 수 있었습니다.
이 프로토콜을 공유하는 우리의 목표는 사용자가 저렴한 장비 및 시약, 무료 생물 정보학 도구를 사용하여 거의 모든 조직 또는 세포주에서 microRNAs의 고품질, 재현 가능한 정량화를 생성 할 수 있도록하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
20 년 전13년 전 microRNAs의 확인에도 불구하고, microRNA 시퀀싱의 과정은 힘든 남아 있고 전문 장비를 필요로, 일상적으로 사내 프로토콜을 채택에서 실험실을 방해14. 그밖 기술은 microRNA 마이크로어레이 및 다중화한 표현 패널 같이 microRNA를 동시에 평가할 수 있습니다; 그러나, 이러한 접근법은 그들의 프로브 세트에 존재하는 microRNAs만 정량화한다는 점에서 제한?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 앤드류 화재와 마크 케이의 실험실의 구성원에게 지침과 제안에 감사드립니다.
Materials
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | NEB | M0242S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
References
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