Um pipeline completo para isolar e sequenciar MicroRNAs e analisá-los usando ferramentas de código aberto
Summary
Aqui, descrevemos uma estratégia passo a passo para isolar pequenas RNAs, enriquecedora para microRNAs e preparando amostras para sequenciamento de alta taxa de transferência. Em seguida, descrevemos como processar leituras de sequência e alinhá-las ao microRNAs, usando ferramentas de código aberto.
Abstract
A metade de todas as transcrições humanas é pensada para ser regulada por microRNAs. Portanto, a quantificação da expressão de microRNA pode revelar mecanismos subjacentes nos Estados de doença e fornecer alvos terapêuticos e biomarcadores. Aqui, detalhamos como quantificar com precisão microRNAs. Resumidamente, este método descreve isolando microRNAs, ligando-os a adaptadores adequados para sequenciamento de alta taxa de transferência, amplificando os produtos finais e preparando uma biblioteca de exemplo. Em seguida, explicamos como alinhar as leituras de sequenciamento obtidas aos grampos de cabelo microRNA e quantificar, normalizar e calcular sua expressão diferencial. Versátil e robusto, este fluxo de trabalho experimental combinado e a análise Bioinformatica permitem que os usuários comecem com a extração do tecido e termine com quantificação de microRNA.
Introduction
Descoberto pela primeira vez em 19931, estima-se agora que cerca de 2000 microRNAs estão presentes no genoma humano2. MicroRNAs são pequenos não-codificando RNAs que são tipicamente 21-24 nucleotídeos longo. São reguladores pós-transcripcionais da expressão gênica, muitas vezes vinculando-se a sítios complementares na região 3-não traduzida (3-UTR) de genes alvo para reprisarem a expressão protéica e degradar o mRNA. Quantificando microRNAs pode dar uma visão valiosa sobre a expressão gênica e vários protocolos foram desenvolvidos para esta finalidade3.
Nós desenvolvemos um protocolo definido, reprodutível, e de longa data para o sequenciamento de RNA pequeno, e para analisar leituras normalizadas usando ferramentas de Bioinformática de código aberto. É importante ressaltar que nosso protocolo possibilita a identificação simultânea de microRNAs endógenos e construções exogenamente entregues que produzem espécies semelhantes a microRNA, enquanto minimiza leituras que mapeiam para outras espécies de RNA pequenas, incluindo RNAs ribossômicas ( rRNAs), transferir RNAs pequenas derivadas de RNA (tsRNAs), RNAs pequenas derivadas de repetição e produtos de degradação de mRNA. Felizmente, os microRNAs são 5-fosforilados e 2-3 hidroxilados4, um recurso que pode ser aproveitado para separá-los dessas outras pequenas RNAs e produtos de degradação de mRNA. Existem várias opções comerciais para a clonagem e sequenciamento do microRNA que muitas vezes são mais rápidas e fáceis de multiplexação; no entanto, a natureza proprietária de reagentes de kit e suas modificações freqüentes faz comparando amostra corre desafiador. Nossa estratégia otimiza a coleta apenas o tamanho correto de microRNAs através de acrilamida e etapas de purificação de gel de agarose. Neste protocolo, também descrevemos um procedimento para alinhar leituras de sequência a microRNAs usando ferramentas de código aberto. Este conjunto de instruções será especialmente útil para usuários de informática novatos, independentemente de se o nosso método de preparação de biblioteca ou um método comercial é usado.
Este protocolo tem sido utilizado em vários estudos publicados. Por exemplo, ele foi usado para identificar o mecanismo pelo qual a enzima Dicer cliva pequenas RNAs hairpin a uma distância de dois nucleotídeos do laço interno da estrutura de loop-tronco-a chamada “regra de contagem de loop”5. Nós igualmente seguimos estes métodos para identificar a abundância relativa de RNAs pequenos entregados do hairpin (shRNA) expressado dos vetores virais adeno-associados de recombinação (rAAVs), para identificar o ponto inicial da expressão de shRNA que pode ser tolerada antes do fígado toxicidade associada à expressão excessiva de shRNA6. Usando este protocolo, nós igualmente identificamos microRNAs no fígado que respondem à ausência de microRNA-122-um microRNA hepatic altamente expressado-ao igualmente caracterizar o teste padrão da degradação deste microRNA7. Porque nós usamos nosso protocolo consistentemente em experiências numerosas, nós pudemos observar longitudinalmente preparações da amostra, e vemos que não há nenhum efeito discernível do grupo.
Ao compartilhar este protocolo, nosso objetivo é permitir que os usuários gerem alta qualidade, quantificação reprodutível de microRNAs em praticamente qualquer linha de tecido ou célula, usando equipamentos e reagentes acessíveis e ferramentas de Bioinformática gratuitas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apesar da identificação de microRNAs há mais de 20 anos,13, o processo de sequenciamento de microRNA permanece trabalhoso e requer equipamentos especializados, impedindo que os laboratórios adotem rotineiramente os protocolos em casa14. Outras técnicas podem simultaneamente avaliar microRNAs, como Microarrays microRNA e painéis de expressão multiplexados; Entretanto, estas aproximações são limitadas que quantificam somente o microRNAs atual em seu jogo da ponta de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer aos membros dos laboratórios de Andrew Fire e Mark Kay por orientação e sugestões.
Materials
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | NEB | M0242S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
References
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