सेलुलर आंदोलन और संबंधित सिग्नलिंग घटनाओं के यांत्रिक नियंत्रण के आकलन के लिए एकल सेल Durotaxis परख
Summary
कक्ष प्रवास को नियंत्रित करने के लिए यांत्रिक बल महत्वपूर्ण होते हैं। इस प्रोटोकॉल लोचदार hydrogels कि एक गिलास micropipette और एक micromanipulator का उपयोग कर विकृत किया जा सकता है के उपयोग को दर्शाता है एक स्थानीय कठोरता ढाल के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए सेल संरचना और प्रवास में परिवर्तन प्रकाश में लाना.
Abstract
ड्यूरोक्सिस वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा कोशिकाएं तनाव की प्रवणता को समझती हैं और प्रतिक्रिया देती हैं। इन विट्रो में इस प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए, एक सेल के अंतर्निहित सब्सट्रेट की कठोरता में हेरफेर किया जाना चाहिए। जबकि वर्गीकृत कठोरता और लंबी अवधि के प्रवास परख के साथ hydrogels durotaxis अध्ययन में उपयोगी साबित कर दिया है, तत्काल, सब्सट्रेट तनाव में स्थानीय परिवर्तन के लिए तीव्र प्रतिक्रियाओं व्यक्तिगत सेल आंदोलनों और subcellular संकेतन घटनाओं के ध्यान केंद्रित अध्ययन की अनुमति. अंतर्निहित सब्सट्रेट कठोरता को व्यक्त करने और प्रतिक्रिया करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता का बार-बार परीक्षण करने के लिए, विकृत hydrogels पर सुसंस्कृत अलग-अलग कोशिकाओं के लिए बढ़ी हुई तनाव के तीव्र ग्रेडिएंट के आवेदन के लिए एक संशोधित विधि का उपयोग किया जाता है जो वास्तविक समय के लिए अनुमति देता है प्रश्न में कोशिकाओं पर प्रदान की गई कठोरता ढाल की शक्ति और दिशा का हेरफेर। इसके अतिरिक्त, ठीक ट्यूनिंग विवरण और परख के मापदंडों, जैसे आकार और micropipette या रिश्तेदार स्थिति, स्थान, और लागू ढाल की दिशा के आयाम के रूप में, परख किसी भी यंत्रवत् के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता संवेदनशील सेल प्रकार और प्रणाली. इन मापदंडों मज़बूती से लागू उत्तेजना बदलने के लिए और परख की कार्यक्षमता और बहुमुखी प्रतिभा का विस्तार करने के लिए बदला जा सकता है. इस विधि दोनों दीर्घकालिक durotactic आंदोलन की परीक्षा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेलुलर संकेतन और कठोरता बदलने के जवाब में रूपात्मक गतिशीलता में और अधिक तत्काल परिवर्तन की अनुमति देता है.
Introduction
पिछले कुछ दशकों में, एक सेल के पर्यावरण के यांत्रिक गुणों के महत्व सेल जीव विज्ञान में बढ़ती मान्यता बढ़ गई है. विभिन्न ऊतकों और extracellular matrices अलग रिश्तेदार कठोरता है और, के रूप में कोशिकाओं को पूरे शरीर में स्थानांतरित, वे इन परिवर्तनों नेविगेट, इन यांत्रिक गुणों का उपयोग करने के लिए उन्हें मार्गदर्शन1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7.कोशिकाओं को किसी दिए गए ऊतक की कठोरता का उपयोग करने के लिए इस तरह के विकास के रूप में प्रक्रियाओं के दौरान उनके गतिशील व्यवहार को सूचित, घाव भरने, और कैंसर मेटास्टेसिस. तथापि, आण्विक तंत्र जो इन यांत्रिक आगतों की अनुभूति और अनुक्रिया की अनुमति देते हैं, काफी हद तकअज्ञात1,2,3,4,5, 6 , 7.
तंत्र है जिसके माध्यम से कोशिकाओं शारीरिक पर्यावरण संकेतों का जवाब का अध्ययन करने के लिए, कठोरता या उपस्तर अंतर्निहित अनुयायी कोशिकाओं की कठोरता हेरफेर किया जाना चाहिए. 2000 में, चुन-मिन लो, यू-ली वांग और उनके सहयोगियों ने एक परख8 विकसित की जिससे यांत्रिक संकेतों को बदलने के लिए एक व्यक्तिगत सेल की गतिशील प्रतिक्रिया को सीधे विकृत extracellular मैट्रिक्स (ECM) लेपित polyacrylamide खींच कर परीक्षण किया जा सकता है हाइड्रोजेल्स जिस पर कोशिकाओं को चढ़ाया गया था। कोशिकाओं कठोर substrates की ओर पलायन के लिए एक महत्वपूर्ण प्राथमिकता दर्शाती है, एक घटना वे “durotaxis” करार दिया.
2000 में मूल रिपोर्ट के बाद से, कई अन्य तकनीकों durotaxis के अध्ययन के लिए नियोजित किया गया है. खड़ी कठोरता ढाल ऐसे polystyrene मोती9 या कड़ी बहुलक पदों10 के रूप में कठोर सुविधाओं पर जैल कास्टिंग द्वारा गढ़ा गया है या एक गिलास coversps11 के किनारों के आसपास substrate polymerizing द्वारा यांत्रिक बनाने के लिए ‘ कदम सीमा’. वैकल्पिक रूप से, उथले लेकिन निश्चित कठोरता ढाल के साथ hydrogels ऐसे microfluidic उपकरणों द्वारा बनाई गई crosslinker के gradients के रूप में तरीकों की एक किस्म के द्वारा निर्मित किया गया है12,13 या पक्ष द्वारा साइड hydrogel समाधान बूंदों भिन्न कठोरता8, या प्रकाश-सक्रिय क्रॉसलिंकर के साथ हाइड्रोजेल्स का एक रेखीय कठोरता ढाल14,15बनाने के लिए वर्गीकृत यूवी प्रकाश जोखिम के साथ इलाज किया जाता है . इन तकनीकों के महान प्रभाव के लिए समय के साथ सामूहिक रूप से durotactic सेलुलर आंदोलन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, आम तौर पर इन सुविधाओं सेल चढ़ाना के अग्रिम में निर्मित कर रहे हैं और उनके गुण प्रयोग के पाठ्यक्रम पर लगातार रहते हैं, यांत्रिक gradients के नमूने के लिए यादृच्छिक सेल आंदोलन पर निर्भर. इन तकनीकों में से कोई भी तीव्र यांत्रिक उत्तेजना के जवाब में सेलुलर व्यवहार में तेजी से परिवर्तन के अवलोकन के लिए सक्षम हैं.
यांत्रिक वातावरण में तीव्र परिवर्तन के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का पालन करने के लिए, एकल सेल durotaxis assays कई फायदे प्रदान करते हैं. इन परखों में, व्यक्तिगत कोशिकाओं को एक कांच माइक्रोपिपेट के साथ सेल से दूर अंतर्निहित सब्सट्रेट खींच कर एक तीव्र, यांत्रिक उत्तेजना दी जाती है, जिससे सेल-मैट्रिक्स तनाव की दिशात्मक ढाल शुरू होती है। गतिशील व्यवहार में परिवर्तन, जैसे गति या प्रवास की दिशा, तो लाइव सेल चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया जाता है. यह दृष्टिकोण यांत्रिक उत्तेजनाओं और सेल प्रवास के बीच कारण और प्रभाव संबंधों के प्रत्यक्ष अवलोकन की सुविधा प्रदान करता है, क्योंकि यह तीव्र गति की अनुमति देता है, तनाव प्रवणता और परिणामी के मूल्यांकन की दिशा और परिमाण के पुनरावर्ती हेरफेर वास्तविक समय में सेलुलर प्रतिक्रियाओं. इसके अलावा, इस विधि भी यंत्रहीन संलयन प्रोटीन या biosensors व्यक्त करने के लिए मशीनों में शामिल होने के लिए संदिग्ध प्रोटीन की मात्रा, गतिविधि, या subcellular स्थानीयकरण में परिवर्तन कल्पना करने के लिए यांत्रिक रूप से कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और ड्यूरोक्सिस।
इस तकनीक के समूहों द्वारा नियोजित किया गया है जो durotaxis8,16 का अध्ययन और यहाँ वर्णित है के रूप में यह Howe प्रयोगशाला द्वारा अनुकूलित किया गया है SKOV-3 डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं और आणविक तंत्र के durotactic व्यवहार का अध्ययन है कि अल्पद्युत द्वन्द्व17| इसके अतिरिक्त, एक संशोधित विधि सेल संस्कृति की सतह के पास एक एकल, फ्लोरोसेंट microspheres की भी परत के साथ hydrogels के निर्माण के लिए वर्णित है; यह माइक्रोपिपेट जनित तनाव ग्रेडिएंट के दृश्य और अनुकूलन की सुविधा प्रदान करता है और कर्षण बल माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल अनुबंधता के मूल्यांकन की अनुमति दे सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ प्रदर्शित एक repeatable, एकल सेल durotaxis परख है कि एक सेल के लिए तीव्र यांत्रिक संकेतों के जवाब में अपने प्रवास व्यवहार को बदलने की क्षमता के आकलन की अनुमति देता है. इस तकनीक को भी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कोई नहीं.
Materials
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
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