فحص Durotaxis خلية واحدة لتقييم السيطرة الميكانيكية للحركة الخلوية والأحداث الإشارات ذات الصلة
Summary
القوى الميكانيكية مهمة للسيطرة على هجرة الخلايا. يوضح هذا البروتوكول استخدام هيدروجيلات مرنة يمكن تشويهها باستخدام ميكرومازيت زجاجي وميكرومنبولاتور لتحفيز الخلايا ذات التدرج المحلي للتصلب لإحداث تغييرات في بنية الخلايا والهجرة.
Abstract
Durotaxis هي العملية التي الخلايا الشعور والاستجابة لدرجات التوتر. من أجل دراسة هذه العملية في المختبر ، يجب التلاعب بصلابة الركيزة الكامنة وراء الخلية. في حين أن المواد المائية مع صلابة متدرجة والاختبارات الهجرة على المدى الطويل أثبتت فائدتها في الدراسات durotaxis، والاستجابات الفورية والحادة للتغيرات المحلية في التوتر الركيزة تسمح دراسة مركزة لحركات الخلايا الفردية والأحداث الإشارات دون الخلوية. لاختبار تكرار قدرة الخلايا على الشعور والاستجابة لصلابة الركيزة الكامنة، يتم استخدام طريقة معدلة لتطبيق التدرجات الحادة من زيادة التوتر على الخلايا الفردية المستزرعة على هيدروجيلات مشوهة مما يسمح في الوقت الحقيقي التلاعب في قوة واتجاه تصلب التدرجات المنقولة على الخلايا المعنية. بالإضافة إلى ذلك، من خلال ضبط تفاصيل ومعلمات الفحص، مثل شكل وأبعاد micropipette أو الموقف النسبي، ووضع، واتجاه التدرج المطبق، يمكن تحسين الفحص لدراسة أي ميكانيكيا نوع الخلية الحساسة والنظام. ويمكن تغيير هذه المعلمات لتغيير موثوق الحوافز المطبقة وتوسيع وظيفة وبراعة الفحص. تسمح هذه الطريقة بفحص كل من الحركة الجوروتيكعلى المدى الطويل، فضلا عن تغييرات فورية أكثر في الإشارات الخلوية والديناميات المورفولوجية استجابة لتغير صلابة.
Introduction
على مدى العقود القليلة الماضية، وقد حصلت أهمية الخصائص الميكانيكية لبيئة الخلية على اعتراف متزايد في بيولوجيا الخلايا. الأنسجة المختلفة والمصفوفات خارج الخلية لها تصلب نسبي مختلف، وكما تهاجر الخلايا في جميع أنحاءالجسم، فإنها تنقل هذه التغييرات، وذلك باستخدام هذه الخصائص الميكانيكية لتوجيهها 1،2،3 , 4 , 5 , 6 , 7.تستخدم الخلايا صلابة أنسجة معينة لإعلام سلوكها الميتيلي أثناء عمليات مثل التنمية، والتئام الجروح، وورم السرطان. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية التي تسمح الإحساس والاستجابة لهذه المدخلات الميكانيكية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير1،2،3،4،5، 6 , 7.
من أجل دراسة الآليات التي من خلالها الخلايا تستجيب للإشارات البيئية المادية، يجب التلاعب صلابة أو صلابة الركيزة الكامنة وراء الخلايا الملتصقة. في عام 2000، وضعت تشون مين لو، يو لي وانغ وزملاؤه اختبار8 حيث استجابة الخلية الفردية motile لتغيير العظة الميكانيكية يمكن اختبارها مباشرة عن طريق تمتد مصفوفة خارج الخلية مشوهة (ECM) المغلفة بولياكريلاميد هيدروجيلات التي كانت مطلية الخلايا. تظهر الخلايا تفضيلًا كبيرًا للهجرة نحو ركائز أكثر صلابة، وهي ظاهرة أطلقوا عليها اسم “durotaxis”.
ومنذ التقرير الأصلي في عام 2000، استخدمت تقنيات أخرى كثيرة لدراسة الدوتاكسيات. وقد تم تصنيع التدرجات صلابة حاد من قبل صب المواد الهلامية على ميزات جامدة مثل حبات البوليسترين9 أو وظائف البوليمر قاسية10 أو عن طريق البلمرة الركيزة حول حواف الأغطية الزجاجية11 لخلق الميكانيكية ‘ خطوة الحدود”. بدلا من ذلك، تم تصنيع هيدروجيلات مع التدرجات تصلب الضحلة ولكن ثابتة من قبل مجموعة متنوعة من الأساليب مثل التدرجات من كروسلينكر التي أنشأتها أجهزة microfluidic12،13 أو جنبا إلى جنب قطرات محلول هيدروجيل من صلابةمختلفة 8، أو هيدروجيلمع كروسلينكر رد الفعل الضوئي تعامل مع التعرض للأشعة فوق البنفسجية متدرجة لخلق التدرج صلابة خطي14،15. وقد استخدمت هذه التقنيات إلى تأثير كبير للتحقيق في الحركة الخلوية الجوروتيك بشكل جماعي مع مرور الوقت. ومع ذلك، عادة ما يتم تصنيع هذه الميزات مقدما من طلاء الخلايا وخصائصها لا تزال متسقة على مدى التجربة، والاعتماد على حركة الخلايا العشوائية لأخذ العينات من التدرجات الميكانيكية. لا يمكن لأي من هذه التقنيات مراقبة التغيرات السريعة في السلوك الخلوي استجابة للمحفزات الميكانيكية الحادة.
من أجل مراقبة الاستجابات الخلوية للتغيرات الحادة في البيئة الميكانيكية، والاختبارات durotaxis خلية واحدة تقدم العديد من المزايا. في هذه الاختبارات، يتم إعطاء الخلايا الفردية التحفيز الحاد والميكانيكي عن طريق سحب الركيزة الكامنة بعيدا عن الخلية مع micropipette الزجاج، وبالتالي إدخال التدرج الاتجاهي من التوتر مصفوفة الخلية. ثم يتم ملاحظة التغيرات في سلوك motile، مثل سرعة أو اتجاه الهجرة، بواسطة مجهرية تباين مرحلة الخلية الحية. وييسر هذا النهج المراقبة المباشرة للعلاقات السببية والفعالة بين المحفزات الميكانيكية وهجرة الخلايا، حيث أنه يسمح بالتلاعب السريع والمتكرر في اتجاه وحجم تدرج التوتر وتقييم ما يترتب عليه من ذلك الردود الخلوية في الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتحفيز ميكانيكيا الخلايا التي تعبر عن البروتينات الانصهار الفلورسنت أو أجهزة الاستشعار الحيويلتصور التغيرات في كمية، نشاط، أو توطين تحت الخلية من البروتينات يشتبه في أن تشارك في المكننة و الدوروسات.
وقد استخدمت هذه التقنية من قبل المجموعات التي تدرس durotaxis8،16 ويوصف هنا كما تم تكييفها من قبل مختبر هاو لدراسة السلوك الجوروتيك من الخلايا السرطانية SKOV-3 والآليات الجزيئية التي تحت [دوروتاكسيس]17. بالإضافة إلى ذلك، يتم وصف طريقة معدلة لتصنيع هيدروجيلمع طبقة واحدة، حتى من ميكروسفيرز الفلورسنت بالقرب من سطح ثقافة الخلية. وهذا يسهل التصور والاستفادة المثلى من التدرجات سلالة micropipette ولدت ويمكن أن تسمح بتقييم انقباض الخلايا عن طريق الفحص المجهري قوة الجر.
Protocol
Representative Results
Discussion
يظهر هنا هو تكرار، فحص durotaxis خلية واحدة التي تسمح بتقييم قدرة الخلية على تغيير سلوكها الهجرة استجابة للإشارات الميكانيكية الحادة. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية في تركيبة مع المجهرية الفلورية والبروتينات الانصهار المناسبة أو أجهزة الاستشعار الحيوية لفحص الإشارات دون الخلوية والأحداث …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي.
Materials
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
References
- Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
- Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
- Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).
- Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
- Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
- Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).
- Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
- Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).
- Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).
