세포 운동 및 관련 신호 이벤트의 기계적 제어를 평가하기위한 단일 세포 Durotaxis 분석
Summary
기계적 힘은 세포 이동을 제어하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 유리 마이크로파이펫 및 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 변형될 수 있는 탄성 하이드로겔의 사용을 입증하여 세포 구조 및 이동의 변화를 유도하기 위해 국소 강성 구배를 가진 세포를 자극한다.
Abstract
Durotaxis는 세포가 긴장의 그라데이션을 감지하고 반응하는 과정입니다. 시험관에서 이 과정을 연구하기 위하여는, 세포의 근본적인 기질의 뻣뻣함은 조작되어야 합니다. 등급이 매겨진 강성과 장기 이동 성 법을 가진 하이드로겔은 durotaxis 연구에서 유용하다는 것이 입증되었지만, 기질 긴장의 국소 변화에 대한 즉각적인 급성 반응은 개별 세포 움직임과 세포 전세포 신호 이벤트에 대한 집중적인 연구를 가능하게 합니다. 기질의 강성을 감지하고 반응하는 세포의 능력을 반복적으로 테스트하기 위해 변형 가능한 하이드로겔에 배양된 개별 세포에 증가된 장력의 급성 구배를 적용하기 위한 수정된 방법이 실시간으로 사용됩니다. 문제의 세포에 부여 된 강성 그라데이션의 강도와 방향의 조작. 또한, 마이크로파이펫의 형상 및 치수 또는 적용된 그라데이션의 상대위치, 배치 및 방향과 같은 분석법의 세부 사항 및 파라미터를 미세 조정함으로써, 분석은 기계적으로 임의의 연구에 최적화될 수 있다. 민감한 세포 유형 및 시스템. 이러한 파라미터는 적용된 자극을 안정적으로 변경하고 분석법의 기능 및 다양성을 확장하도록 변경될 수 있다. 이 방법은 장기 durotactic 운동뿐만 아니라 변화하는 강성에 대한 응답으로 세포 신호 및 형태 역학의 더 즉각적인 변화의 검사를 할 수 있습니다.
Introduction
지난 수십 년 동안, 세포 환경의 기계적 특성의 중요성은 세포 생물학에서 점점 더 인정을 얻고있다. 다른 조직과 세포 외 행렬은 다른 상대 강성을 가지고 있으며, 세포가 몸 전체에 마이그레이션할 때,그들은 그들을 안내하기 위해 이러한 기계적 특성을 사용하여 이러한 변화를 탐색 1,2,3 , 4개 , 5개 , 6개 , 7. 세포는 발달, 상처 치유 및 암 전이와 같은 과정에서 운동성 행동을 알리기 위해 주어진 조직의 뻣뻣함을 사용합니다. 그러나, 이러한 기계적 입력의 감각과 반응을 허용하는 분자 메커니즘은 크게 알 수없는 남아1,2,3,4,5, 6개 , 7.
세포가 물리적 환경 단서에 반응하는 메커니즘을 연구하기 위해서는 기질의 강성 또는 강성을 조작해야 합니다. 2000년, 전민로, 유리왕과 동료들은 분석8을 개발하여 변형 가능한 세포외 매트릭스(ECM) 코팅 폴리아크릴아미드를 스트레칭하여 기계큐를 변화시키는 개별 세포의 운동성 반응을 직접 테스트할 수 있었습니다. 세포가 도금된 하이드로겔. 세포는 더 단단한 기판으로 이동하는 것에 대한 상당한 선호를 나타내며, 이는 “듀로탁시스”라고 불리는 현상입니다.
2000년 최초의 보고서 이후, 듀로탁시스 연구에 다른 많은 기술이 사용되었습니다. 가파른 강성 그라데이션은 폴리스티렌 비드9 또는 뻣뻣한 폴리머포스트(10)와 같은 단단한 특징에 겔을 주조하여 제조되었거나 유리 커버슬립(11)의 가장자리 주위에 기판을 중합하여 기계적 을 만들어 ‘ 스텝 경계’. 양자택일로, 얕지만 고정된 강성 그라데이션을 가진 하이드로겔은 미세 유체 장치12,13 또는 나란히 하이드로겔 용액 방울에 의해 생성된 가교의 그라데이션과 같은 다양한 방법에 의해 제조되었습니다. 다른 강성8,또는 선형 강성 그라데이션14,15를만들기 위해 등급UV 광 노출로 처리 광 반응성 크로스 링커하이드로겔. 이러한 기술은 시간이 지남에 따라 한꺼번에 durotactic 세포 운동을 조사하는 큰 효과에 사용되어왔다. 그러나, 전형적으로 이러한 특징은 세포 도금 의 앞에 제조되고 그 특성은 기계적인 그라데이션의 샘플링을 위한 무작위 세포 운동에 의존하여 실험의 과정을 통해 일관되게 유지됩니다. 이러한 기술 중 어느 것도 급성 기계적 자극에 반응하여 세포 행동의 급격한 변화를 관찰 할 수 없습니다.
기계적인 환경에 있는 급격한 변경에 세포 반응을 관찰하기 위하여는, 단세포 durotaxis 반응은 몇몇 이점을 제안합니다. 이러한 세포에서, 개별 세포는 유리 마이크로파이펫으로 세포로부터 근본적인 기판을 당겨서 급성, 기계적 자극을 부여하여, 세포 매트릭스 장력의 방향구배를 도입한다. 이동 속도 또는 이동 방향과 같은 운동성 거동에 대한 변화는 살아있는 세포 상 대비 현미경 검사법에 의해 관찰됩니다. 이 접근법은 기계적 자극과 세포 이동 사이의 원인과 효과 관계를 직접 관찰할 수 있게 해주며, 이로 인해 장력 구배의 방향과 크기를 신속하고 반복적으로 조작할 수 있습니다. 실시간으로 셀룰러 응답. 또한, 이 방법은 또한 형광 융합 단백질 또는 바이오센서를 발현하는 세포를 기계적으로 자극하여 메카노센싱에 관여하는 것으로 의심되는 단백질의 양, 활성 또는 세포외 국소화의 변화를 시각화하는 데 사용될 수 있으며, 듀로탁시스.
이 기술은 durotaxis8,16을 공부하는 단에 의해 채택되고 SKOV-3 난소 암 세포의 durotactic 행동을 공부하고 분자 기계장치를 공부하기 위하여 하우 실험실에 의해 적응된 것과 같이 여기에서 기술됩니다 언더리 듀로탁시스17. 부가적으로, 변형된 방법은 세포 배양 표면 근처의 단일, 짝수 층의 형광 미소구층을 가진 하이드로겔의 제조를 위해 기술되고; 이것은 마이크로파이펫 생성 된 변형 구이의 시각화 및 최적화를 용이하게하고 견인력 현미경 검사법에 의한 세포 수축도의 평가를 허용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 입증된 것은 급성 기계적인 단서에 응하여 그것의 이동 행동을 변경하는 세포의 기능의 평가를 허용하는 반복가능한, 단세포 durotaxis 분석입니다. 이 기술은 또한 형광 현미경 검사법 및 적절한 융합 단백질 또는 바이오 센서와 함께 기계적 자극의 초 이내에 또는 더 긴 기간 동안 세포 간 신호 및 세포 골격 이벤트를 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 듀로틱 운동. 세포와 세포의 환경 관?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
없음.
Materials
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
References
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