Enkelvoudige cel Duro Taxis assay voor de beoordeling van de mechanische controle van cellulaire beweging en gerelateerde signalering van gebeurtenissen
Summary
Mechanische krachten zijn belangrijk voor het beheersen van de Celmigratie. Dit protocol demonstreert het gebruik van elastische hydrogels die kunnen worden vervormd met behulp van een glazen micro pipet en een micro manipulator om cellen te stimuleren met een lokale stijfheids gradiënt om veranderingen in celstructuur en migratie teweeg te brengen.
Abstract
Durotaxis is het proces waarbij cellen zich voelen en reageren op gradiënten van spanningen. Om dit proces in vitro te bestuderen, moet de stijfheid van de onderliggende ondergrond van een cel worden gemanipuleerd. Terwijl hydrogels met gegradeerde stijfheid en lange termijn Migratietesten zijn nuttig gebleken in durotaxis studies, onmiddellijke, acute reacties op lokale veranderingen in substraat spanning toestaan gerichte studie van individuele celbewegingen en subcellulaire signalering van gebeurtenissen. Om het vermogen van cellen op een herhaaldelijk manier te testen en te reageren op de onderliggende substraat stijfheid, wordt een aangepaste methode gebruikt voor het aanbrengen van acute gradiënten van verhoogde spanning op individuele cellen die worden gekweekt op vervormbare hydrogels, die real-time manipulatie van de sterkte en de richting van de stijfheid gradiënten op de cellen in kwestie. Door de details en parameters van de Assay, zoals de vorm en afmetingen van de micro pipet of de relatieve positie, plaatsing en richting van de toegepaste gradiënt, te finetuning, kan de test bovendien worden geoptimaliseerd voor de studie van een mechanisch gevoelig celtype en-systeem. Deze parameters kunnen worden gewijzigd om de toegepaste stimulus betrouwbaar te veranderen en de functionaliteit en veelzijdigheid van de test uit te breiden. Deze methode maakt onderzoek van zowel de lange termijn durotactische beweging als meer directe veranderingen in cellulaire signalering en morfologische dynamiek in reactie op veranderende stijfheid.
Introduction
De laatste decennia is het belang van de mechanische eigenschappen van de omgeving van een cel toegenomen erkenning in de celbiologie. Verschillende weefsels en extracellulaire matrices hebben verschillende relatieve verstijmen en, als cellen migreren door het hele lichaam, ze navigeren deze veranderingen, met behulp van deze mechanische eigenschappen om hen te begeleiden1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. cellen gebruiken de stijfheid van een bepaald weefsel om hun beweeglijke gedrag te informeren tijdens processen zoals ontwikkeling, wondgenezing en kanker metastasen. Echter, de moleculaire mechanismen die het gevoel van en reactie op deze mechanische ingangen kunnen blijven grotendeels onbekend1,2,3,4,5, 6 , 7.
Om de mechanismen te bestuderen waardoor cellen reageren op fysieke omgevings aanwijzingen, moeten de stijfheid of stijfheid van het onderliggende substraat van de cellen worden gemanipuleerd. In 2000 ontwikkelden Chun-min Lo, Yu-Li Wang en collega’s een assay8 waarbij de beweeglijke respons van een individuele cel op veranderende mechanische signalen direct kan worden getest door het strekken van vervormbare extracellulaire matrix (ECM)-gecoate Polyacrylamide hydrogels waarop de cellen zijn geplateerd. Cellen vertoont een belangrijke voorkeur voor de migratie naar stijvere substraten, een fenomeen dat ze “durotaxis” nagesynchroniseerde.
Sinds het oorspronkelijke rapport in 2000 zijn vele andere technieken gebruikt voor de studie van durotaxis. Steile stijfheids gradiënten zijn vervaardigd door gels te gieten over stijve functies zoals polystyreen kralen9 of stijve polymeer palen10 of door het substraat rond de randen van een glazen dekstroken te polymeriseren11 om mechanische ‘ Step-grenzen ‘. Als alternatief zijn hydrogels met onlagere maar vaste stijfheids gradiënten vervaardigd door een verscheidenheid aan methoden, zoals gradiënten van als gemaakt door microfluïdische apparaten12,13 of side-by-side hydrogel oplossing druppels van verschillende stijfheid8, of hydrogels met photoreactive als behandeld met Graded blootstelling aan UV-licht om een lineaire stijfheid gradiënt14,15te creëren. Deze technieken zijn gebruikt om een groot effect te onderzoeken durotactische cellulaire beweging en masse na verloop van tijd. Echter, meestal zijn deze functies vervaardigd op voorhand van celplating en hun eigenschappen blijven consistent in de loop van het experiment, afhankelijk van willekeurige celbeweging voor bemonstering van mechanische verlopen. Geen van deze technieken zijn vatbaar voor waarneming van snelle veranderingen in cellulaire gedrag in reactie op acute mechanische stimulus.
Om te observeren cellulaire reacties op acute veranderingen in de mechanische omgeving, eencellige durotaxis assays bieden verschillende voordelen. In deze tests krijgen individuele cellen een acute, mechanische stimulans door het onderliggende substraat weg te trekken van de cel met een glazen micro Pipet, waardoor een richtings gradiënt van de celmatrix spanning wordt ingevoerd. Veranderingen in het beweeglijke gedrag, zoals snelheid of richting van de migratie, worden vervolgens waargenomen door de Live-cel fase contrast microscopie. Deze aanpak vergemakkelijkt directe observatie van oorzaak en gevolg relaties tussen mechanische stimuli en Celmigratie, omdat het een snelle, iteratieve manipulatie van de richting en de grootte van de spannings gradiënt mogelijk maakt en de beoordeling van de daaruit voortvloeiende cellulaire reacties in real-time. Verder kan deze methode ook worden gebruikt om cellen die fluorescerende fusie proteïnen of biosensoren uitdrukken, mechanisch te stimuleren om veranderingen in de hoeveelheid, activiteit of subcellulaire lokalisatie van eiwitten die vermoedelijk betrokken zijn bij mechanosensing te visualiseren en durotaxis.
Deze techniek is gebruikt door groepen die durotaxis8,16 bestuderen en wordt hier beschreven omdat het door het Howe laboratorium is aangepast om het durotactische gedrag van SKOV-3 ovariële kankercellen te bestuderen en de moleculaire mechanismen die rela durotaxis17. Daarnaast wordt een gemodificeerde methode beschreven voor de fabricage van hydrogels met een enkele, gelijkmatige laag van fluorescerende microsferen in de buurt van het celkweek oppervlak; Dit vergemakkelijkt de visualisatie en optimalisatie van door micro pipet gegenereerde stam gradiënten en kan een beoordeling van de contractiliteit van de cellen door tractiekracht microscopie mogelijk maken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier gedemonstreerd is een herhaalbare, eencellige durotaxis assay die het mogelijk maakt om de mogelijkheid van een cel om zijn migratie gedrag te veranderen in reactie op acute mechanische aanwijzingen. Deze techniek kan ook worden gebruikt in combinatie met fluorescentiemicroscopie en geschikte fusie proteïnen of biosensoren om subcellulaire signalering en cytoskelet gebeurtenissen binnen enkele seconden na mechanische stimulatie of over een langere tijdschaal te onderzoeken tijdens durotactische beweging. Het begrij…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geen.
Materials
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
References
- Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
- Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
- Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).
- Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
- Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
- Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).
- Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
- Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).
- Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).
