Single Cell Durotaxis analysen for vurdering mekanisk kontroll av Cellular Movement og relaterte signalering Events
Summary
Mekaniske krefter er viktig for å kontrollere celle migrering. Denne protokollen demonstrerer bruken av elastiske hydrogeler som kan deformeres ved hjelp av et glass micropipette og en micromanipulator for å stimulere celler med en lokal stivhet gradient å lokke fram endringer i cellestruktur og migrasjon.
Abstract
Durotaxis er prosessen der cellene forstand og reagere på graderinger av spenning. For å studere denne prosessen in vitro, stivhet av underlaget underliggende en celle må manipuleres. Mens hydrogeler med gradert stivhet og langsiktige migrasjon analyser har vist seg nyttig i durotaxis studier, umiddelbare, akutte reaksjoner på lokale endringer i underlaget spenning tillate fokusert studie av individuelle celle bevegelser og subcellulære signalering hendelser. For å repeatably teste evnen til cellene til å oppfatte og reagere på den underliggende underlaget stivhet, en modifisert metode for anvendelse av akutte graderinger av økt spenning til individuelle celler kultivert på deformerbare hydrogeler brukes som tillater for sanntids manipulering av styrke og retning av stivhet gradienter formidles på celler i spørsmålet. I tillegg, ved å finjustere detaljene og parametrene av analysen, slik som form og dimensjoner av micropipette eller den relative posisjon, plassering, og retning av anvendt gradient, kan analysen optimaliseres for studiet av mekanisk sensitiv celle type og system. Disse parametrene kan endres for å pålitelig endre anvendt stimulans og utvide funksjonaliteten og allsidigheten til analysen. Denne metoden tillater undersøkelse av både langsiktig durotactic bevegelse samt mer umiddelbare endringer i mobilnettet signalering og morfologiske dynamikk som svar på skiftende stivhet.
Introduction
I løpet av de siste ti årene har betydningen av de mekaniske egenskapene til en celle miljø fått økende anerkjennelse i cellebiologi. Ulike vev og ekstracellulære matriser har ulike relative stiffnesses og, som cellene migrere i hele kroppen, navigerer de disse endringene, ved hjelp av disse mekaniske egenskaper for å veilede dem1,2,3 , 4 andre priser , 5 andre priser , 6 andre priser , 7. Cells bruke stivhet av en gitt vev for å informere sine aktive atferd under prosesser som utvikling, sår healing, og kreft metastasering. Men den molekylære mekanismer som tillater følelse av og respons på disse mekaniske innganger fortsatt i stor grad ukjent1,2,3,4,5, 6 andre priser , 7i.
For å studere mekanismene gjennom hvilke celler reagerer på fysiske miljømessige signaler, må stivhet eller stivhet av underlaget underliggende tilhenger celler manipuleres. I 2000, Chun-min lo, Yu-Li Wang og kolleger utviklet en analyse8 der en individuell celle aktive respons på skiftende mekaniske signaler kan være direkte testet ved å strekke deformerbare ekstracellulære MATRISE (ECM)-belagt polyakrylamid hydrogeler som cellene var belagt. Celler viser en betydelig preferanse for å migrere mot stivere underlag, et fenomen de kalte “durotaxis.”
Siden den opprinnelige rapporten i 2000, har mange andre teknikker vært ansatt for studiet av durotaxis. Bratt stivhet graderinger har vært fabrikkert ved støping gels over stive funksjoner som polystyren perler9 eller stiv polymer innlegg10 eller ved lysherde underlaget rundt kantene av et glass coverslips11 for å lage mekaniske ‘ trinn-grenser ‘. Alternativt, hydrogeler med grunnere men fast stivhet graderinger har vært fabrikkert ved en rekke metoder som graderinger av tverrbinder opprettet av mikrovæskebasert enheter12,13 eller side-ved-side hydrogel løsning dråper av ulik stivhet8, eller hydrogeler med photoreactive tverrbinder behandlet med gradert UV-lys eksponering for å skape en lineær stivhet gradient14,15. Disse teknikkene har blitt brukt til stor effekt for å undersøke durotactic Cellular bevegelse en masse over tid. Men vanligvis disse funksjonene er fabrikkert i forkant av celle plating og deres egenskaper forblir konsistent i løpet av eksperimentet, avhengig av tilfeldig celle bevegelse for prøvetaking av mekaniske graderinger. Ingen av disse teknikkene er mottagelig for observasjon av raske endringer i cellulære atferd som svar på akutt mekanisk stimulans.
For å observere cellulære svar på akutte endringer i mekanisk miljø, én celle durotaxis analyser tilbyr flere fordeler. I disse analysene, er individuelle celler gitt en akutt, mekanisk stimulans ved å trekke den underliggende underlaget bort fra cellen med et glass micropipette, og dermed innføre en retningsbestemt gradient av celle-matrise spenning. Endringer i aktive atferd, for eksempel hastighet eller retning av migrasjon, blir deretter observert av Live-celle fase kontrast mikroskopi. Denne tilnærmingen forenkler direkte observasjon av årsak og virkning relasjoner mellom mekaniske stimuli og celle migrasjon, som det gir rask, repeterende manipulasjon av retningen og omfanget av spenningen gradient og vurdering av påfølgende cellulære responser i sanntid. Videre kan denne metoden også brukes til å mekanisk stimulere celler uttrykker fluorescerende Fusion proteiner eller biosensors å visualisere endringer i mengden, aktivitet, eller subcellulære lokalisering av proteiner mistenkt for å være involvert i mechanosensing og durotaxis.
Denne teknikken har vært ansatt av grupper somstuderer durotaxis og er beskrevet her som det har blitt tilpasset av den Howe laboratoriet for å studere durotactic Behavior of SKOV-3 eggstokkene kreftceller og den molekylære mekanismer som underliggende durotaxis17. I tillegg er en modifisert metode beskrevet for fabrikasjon av hydrogeler med en enkelt, selv lag av fluorescerende mikrosfærer nær cellen kulturen overflaten; Dette forenkler visualisering og optimalisering av micropipette-genererte strekk graderinger og kan tillate vurdering av celle contractility av traction Force mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Demonstrert her er en repeterbar, Single-Cell durotaxis analysen som tillater vurdering av en celle evne til å endre sin migrasjon atferd som svar på akutte mekaniske signaler. Denne teknikken kan også brukes i kombinasjon med fluorescens mikroskopi og passende Fusion proteiner eller biosensors for å undersøke subcellulære signalering og cytoskjelettkomponenter hendelser i løpet av sekunder av mekanisk stimulering eller over en lengre tidsskala under durotactic bevegelse. Forstå en celle forhold til sine omgivels…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen.
Materials
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
References
- Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
- Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
- Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).
- Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
- Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
- Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).
- Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
- Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).
- Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).
