Enkel cell Durotaxis analys för bedömning av mekanisk kontroll av cellulära rörelser och relaterade signalering händelser
Summary
Mekaniska krafter är viktiga för att styra cell migration. Detta protokoll visar användningen av elastiska hydrogeler som kan deformeras med hjälp av en glasmikropipett och en micromanipulator för att stimulera celler med en lokal styvhet gradient för att framkalla förändringar i cellstruktur och migration.
Abstract
Durotaxis är den process genom vilken celler mening och reagera på gradienter av spänningar. För att studera denna process in vitro måste styvheten hos underlaget som ligger bakom en cell manipuleras. Medan hydrogeler med graderad styvhet och långsiktig migration analyser har visat sig användbara i durotaxis studier, omedelbara, akuta svar på lokala förändringar i substrat spänning tillåta fokuserad studie av enskilda cell rörelser och subcellulära signalering händelser. För att repeterbart testa cellernas förmåga att känna av och reagera på underliggande substrat stelhet, används en modifierad metod för applicering av akuta gradienter av ökad spänning till enskilda celler som odlas på deformerbara hydrogeler som möjliggör realtids manipulation av styrkan och riktningen av styvhet gradienter förmedlas på celler i fråga. Dessutom, genom att finjustera detaljerna och parametrarna för analysen, såsom form och dimensioner av mikropipett eller den relativa positionen, placering och riktning av den tillämpade gradienten, kan analysen optimeras för studier av alla mekaniskt känslig celltyp och system. Dessa parametrar kan ändras för att tillförlitligt ändra den tillämpade stimulansen och utöka funktionaliteten och mångsidigheten hos analysen. Denna metod möjliggör undersökning av både långsiktig durotaktisk rörelse samt mer omedelbara förändringar i cellulära signalering och morfologisk dynamik som svar på förändrade styvhet.
Introduction
Under de senaste decennierna har vikten av de mekaniska egenskaperna hos en cells miljö samlat allt större erkännande i cellbiologi. Olika vävnader och extracellulära matriser har olika relativa styvheter och, som celler migrerar i hela kroppen, de navigerar dessa förändringar, med hjälp av dessa mekaniska egenskaper för att vägleda dem1,2,3 , 4 , ,5 , 6 , 7. celler använder styvheten hos en given vävnad för att informera deras motila beteende under processer som utveckling, sårläkning, och cancermetastaser. Men de molekylära mekanismer som gör att känslan av och reaktionen på dessa mekaniska ingångar är i stort sett okänd1,2,3,4,5, 6 , 7.
För att studera de mekanismer genom vilka celler reagerar på fysiska Miljösignaler, måste styvheten eller styvheten hos det substrat som underliggande vidsittande celler manipuleras. I 2000, Chun-min Lo, Yu-Li Wang och kollegor utvecklat ett test8 där en enskild cells motila svar på förändrade mekaniska signaler kan testas direkt genom sträckning deformerbara extracellulära matrix (ECM)-belagda polyakrylamid hydrogeler på vilka cellerna var pläterade. Celler uppvisar en betydande preferens för att migrera mot styvare substrat, ett fenomen som de dubbade “durotaxis.”
Sedan den ursprungliga rapporten i 2000, många andra tekniker har varit anställd för studiet av durotaxis. Branta styvhet gradienter har tillverkats av gjutning geler över stela funktioner såsom polystyren pärlor9 eller styv polymer inlägg10 eller genom att polymerisera underlaget runt kanterna på ett glas täckband11 för att skapa mekaniska ” steg gränser “. Alternativt, hydrogeler med grundare men fast styvhet gradienter har tillverkats av en mängd olika metoder såsom gradienter av crosslinker skapas av mikroflödessystem enheter12,13 eller sida-vid-sida hydrogel lösning droppar av olika styvhet8, eller hydrogeler med fotoreaktiv crosslinker behandlas med graderad UV-ljus exponering för att skapa en linjär styvhet lutning14,15. Dessa tekniker har använts till stor effekt för att undersöka durotaktisk cellulära rörelse en masse över tiden. Emellertid, typiskt dessa funktioner är fabricerade i förväg av cellplätering och deras egenskaper förblir konsekvent under loppet av experimentet, förlitar sig på slumpmässiga cellförflyttning för provtagning av mekaniska gradienter. Ingen av dessa tekniker är mottagliga för observation av snabba förändringar i cellulära beteende som svar på akut mekanisk stimulans.
För att observera cellulära svar på akuta förändringar i den mekaniska miljön, enda cell durotaxis analyser erbjuder flera fördelar. I dessa analyser, enskilda celler ges en akut, mekanisk stimulans genom att dra det underliggande substratet bort från cellen med en glasmikropipett, därigenom införa en riktad gradient av cell-matris spänning. Förändringar i motila beteende, såsom hastighet eller riktning av migration, observeras sedan av levande cell faskontrast mikroskopi. Denna metod underlättar direkt observation av orsak och verkan samband mellan mekaniska stimuli och cell migration, eftersom det möjliggör snabb, iterativ manipulation av riktningen och omfattningen av spänningen lutning och bedömning av åtföljande cellulära svar i realtid. Vidare kan denna metod också användas för att mekaniskt stimulera celler som uttrycker fluorescerande fusions proteiner eller biosensorer för att visualisera förändringar i mängden, aktiviteten eller den subcellulära lokaliseringen av proteiner som misstänks vara involverade i mechanosensing och durotaxis.
Denna teknik har varit anställd av grupper som studerar durotaxis8,16 och beskrivs här som det har anpassats av Howe laboratorium för att studera det durotaktiska beteendet hos SKOV-3 äggstockscancer celler och de molekylära mekanismer som un durotaxis17. Dessutom beskrivs en modifierad metod för tillverkning av hydrogeler med ett enda, jämnt skikt av fluorescerande mikrosfärer nära cellkultur ytan; Detta underlättar visualisering och optimering av mikropipett-genererade stam gradienter och kan möjliggöra bedömning av cell kontraktilitet genom dragkraft mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Demonstreras här är en repeterbar, encelliga durotaxis test som möjliggör bedömning av en cells förmåga att förändra sin migration beteende som svar på akuta mekaniska signaler. Denna teknik kan också användas i kombination med fluorescensmikroskopi och lämpliga fusions proteiner eller biosensorer för att undersöka subcellulär signalering och cytoskeletala händelser inom några sekunder efter mekanisk stimulering eller över en längre tidsskala under durotaktisk rörelse. Förstå en cells relation till…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen.
Materials
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
References
- Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
- Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
- Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).
- Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
- Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
- Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).
- Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
- Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).
- Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).
