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Abstract
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Cancer Research

Obtenir des sphères de cellules souches cancéreuses à partir de tumeurs gynécologiques et du cancer du sein

Published: March 01, 2020
doi:
10.3791/60022
, , , , , , ,
1Institute of Biophysics, Faculty of Medicine,University of Coimbra, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), Faculty of Medicine,University of Coimbra, 3CNC.IBILI/Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB),University of Coimbra, 4Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 5Universitary Clinic of Gynecology, Faculty of Medicine,University of Coimbra, 6Gynecology A Service,Coimbra Hospital and Universitary Center, 7Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Faculty of Medicine,University of Coimbra, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine,University of Coimbra, 9Cytometry Operational Management Unit, Clinical Pathology Service,Coimbra Hospital and Universitary Center, 10Polytechnic Institute of Coimbra, ESTESC-Coimbra Health School,Laboratory Biomedical Sciences

Summary

L’objectif de cette méthodologie est d’identifier les cellules souches cancéreuses (CSC) dans les lignées de cellules cancéreuses et les échantillons primaires de tumeurs humaines avec le protocole de formation de sphère, d’une manière robuste, en utilisant des essais fonctionnels et la caractérisation phénotypique avec cytométrie du flux et de l’Ouest Tache.

Abstract

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont une petite population avec l’auto-renouvellement et la plasticité qui sont responsables de la tumorigénèse, la résistance au traitement et la maladie récurrente. Cette population peut être identifiée par des marqueurs de surface, une activité enzymatique et un profil fonctionnel. Ces approches en soi sont limitées, en raison de l’hétérogénéité phénotypique et de la plasticité du SCC. Ici, nous mettons à jour le protocole de formation de sphère pour obtenir des sphères de CSC des cancers du sein et gynécologiques, évaluant des propriétés fonctionnelles, des marqueurs de CSC et l’expression de protéine. Les sphères sont obtenues avec l’ensemencement unicellulaire à faible densité dans la culture de suspension, en utilisant un milieu semi-solide de méthylcellulose pour éviter la migration et les agrégats. Ce protocole rentable peut être utilisé dans les lignées cellulaires cancéreuses, mais aussi dans les tumeurs primaires. La culture tridimensionnelle de suspension non-adhérente pensée pour imiter le microenvironnement de tumeur, particulièrement le CSC-niche, est complétée avec le facteur épidermique de croissance et le facteur de croissance de base de fibroblaste pour assurer la signalisation de CSC. Visant une identification robuste du SCC, nous proposons une approche complémentaire, combinant l’évaluation fonctionnelle et phénotypique. La capacité de formation de sphère, l’auto-renouvellement et la zone de projection de sphère établissent des propriétés fonctionnelles de CSC. En outre, la caractérisation comprend l’évaluation de la cytométrie du débit des marqueurs, représentés par CD44/CD24– et CD133, et Western blot, compte tenu de l’ALDH. Le protocole présenté a également été optimisé pour les échantillons primaires de tumeur, suivant une procédure de digestion d’échantillon, utile pour la recherche translationnelle.

Introduction

Les populations cancéreuses sont hétérogènes, avec des cellules présentant différentes morphologies, la prolifération et la capacité d’invasion, en raison de l’expression différentielle des gènes. Parmi ces cellules, une population minoritaire existe des cellules souches cancéreuses (CSC)1, qui ont la capacité d’auto-renouvellement, récapitulant l’hétérogénéité de la niche tumorale primaire et produisant des progéniteurs aberrants différenciants qui ne répondent pas adéquatement aux contrôles homéostatiques2. Les propriétés de CSC peuvent être directement traduites dans la pratique clinique, étant donné l’association avec des événements, tels que la tumorigénicité ou la résistance à la chimiothérapie3. L’identification du SCC peut mener à la mise au point de thérapies ciblées qui peuvent inclure le blocage des marqueurs de surface, la promotion de la différenciation du SCC, le blocage des composantes de la voie de signalisation du SCC, la destruction des niches et les mécanismes épigénétiques4.

L’isolement du SCC a été effectué dans les lignées de cellules et dans des échantillons de tumeurs primaires5,6,7,8. Le profil fonctionnel décrit pour le SCC comprend la capacité clonogène, la population latérale et la formation de tumorosphère9. Le phénotypefaible cD44élevé/CD24 a été uniformément associé au CSC de sein, qui s’est avéré être tumorigenic in vivo et a été déjà associé à la transition épithéliale à la transition mésenchymale5,10. L’activité élevée d’ALDH a été également associée à la tige et à la transition épithéliale à la transition mésenchymale (EMT) dans plusieurs types de tumeurs pleines11. L’expression d’ALDH a été associée à la résistance à la chimiothérapie et au phénotype de CSC in vitro12,13,14,15,16. Plusieurs autres marqueurs ont été liés aux propriétés du SCC dans différents types de tumeurs, comme CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 et d’autres, comme décrit dans le tableau 1.

Les tumorspheres se composent d’un modèle tridimensionnel pour l’étude et l’expansion de CSC. Dans ce modèle, les suspensions cellulaires des lignées cellulaires et des échantillons de sang ou de tumeur sont cultivées dans un milieu complété par des facteurs de croissance, à savoir le facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance de base du fibroblaste (bFGF), sans sérum bovin fœtal et dans des conditions non adhérentes17. L’inhibition de l’adhérence cellulaire entraîne la mort par anoikis de cellules différenciées18. Les sphères sont dérivées de la croissance clonale d’une cellule isolée. À cette fin, les cellules sont distribuées à faible densité pour éviter la fusion cellulaire et l’agrégation19. Une autre stratégie comprend l’utilisation de la méthylcellulose semi-solide20.

Le protocole de formation de sphère a gagné la popularité dans l’isolement et l’expansion de CSC, en raison du temps et du coût et des raisons techniques, profitables, et reproductibles21,22. Malgré certaines réserves sur l’étendue de la formation de sphère soumet le SCC, il y a une propension des cellules souches à se développer dans des conditions non adhérentes avec le phénotype caractéristique, qui ressemble au microenvironnement indigène21. Aucune des méthodes disponibles pour l’isolement du SCC des tumeurs pleines n’a l’efficacité complète, soulignant l’importance de développer des marqueurs plus spécifiques ou des combinaisons des méthodologies et des marqueurs.

Dans ce protocole, nous détaillons l’isolement du SCC avec le protocole de formation de sphère, avec le principe de la croissance unicellulaire dans des conditions non adhérentes et la capacité de produire un phénotype différencié. Une représentation schématique de cette procédure est représentée à la figure 1. Nous décrivons également la caractérisation avec des marqueurs de surface et l’expression d’ALDH pour CSC, pour des lignes de cellules de tumeur de sein et gynécologiques et des échantillons des tumeurs primaires.

Protocol

Ce protocole a été exécuté conformément aux directives éthiques de la Banque de tumeurs de l’Hôpital et du Centre Universitaire de Coimbra (CHUC), et a été approuvé par le Comité d’éthique de la santé du CHUC et par la Commission nationale portugaise de protection des données. 1. Protocole de formation de sphères et populations adhérentes dérivées des cultures cellulaires continues REMARQUE : Effectuez toutes les procédures dans des conditions s…

Representative Results

Le protocole de formation de sphère permet d’obtenir des colonies sphériques en suspension à partir de plusieurs lignées cellulaires de l’endomètre et du cancer du sein (figure 2A) ou après une digestion enzymatique douce des tissus provenant d’échantillons de tumeurs humaines (Figure 2E). Dans les deux cas, quelques jours après le placage, des colonies sphériques monoclonales en suspension sont obtenues. Les sph?…

Discussion

Ce protocole détaille une approche pour obtenir des tumorspheres des lignées de cellules cancéreuses et des échantillons humains primaires. Les tumorsphères sont enrichies dans une sous-population avec des propriétés de cellules souches36. Cet enrichissement au SCC dépend de la viabilité dans un environnement sans ancrage alors que les cellules différenciées dépendent de l’adhérence à un substrat37. Comme le placage primaire des cellules tumorales dans un en…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par la Société portugaise de gynécologie par le Prix de recherche 2016 et par CIMAGO. Cnc. L’IBILI est soutenue par la Fondation pour la science et la technologie, Portugal (UID/NEU/04539/2013), et cofinancée par FEDER-COMPETE (POCI-01-01-0145-FEDER-007440). La Banque de tumeurs de l’Hôpital et du Centre Universitaire de Coimbra (CHUC), agréée par le Comité d’éthique de la santé du CHUC et par la Commission nationale portugaise de protection des données, a été la source d’échantillons d’endomètre de patients suivis au Service de gynécologie de l’établissement. Figure 1 a été produite à l’aide de Servier Medical Art, disponible à partir de www.servier.com.

Materials

Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
��-actin antibody Sigma A5316
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Laranjo, M., Carvalho, M. J., Serambeque, B., Alves, A., Marto, C. M., Silva, I., Paiva, A., Botelho, M. F. Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors. J. Vis. Exp. (157), e60022, doi:10.3791/60022 (2020).
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