この方法論の目的は、癌細胞株および原発ヒト腫瘍試料中の癌幹細胞(CSC)を、細胞細胞の機能性アッセイと表現型特性評価を用いて堅牢に同定することである。しみ。
がん幹細胞(CSC)は、腫瘍の発生、治療に対する耐性および再発性疾患の原因となる自己再生性および可塑性を有する小さな集団である。この集団は、表面マーカー、酵素活性および機能的プロファイルによって同定することができる。これらのアプローチは、その他、異種性とCSC可塑性のため、制限されています。ここでは、球体形成プロトコルを更新して、乳癌および婦人科癌からCSC球体を取得し、機能的特性、CSCマーカーおよびタンパク質発現を評価する。球体は、遊入および凝集を回避するために半固体メチルセルロース培地を用いて、懸濁培養における低密度での単細胞播種で得られる。この有益なプロトコルは、癌細胞株だけでなく、原発性腫瘍でも使用することができる。三次元非接着性懸濁液培養は、腫瘍微小環境、特にCSCニッチを模倣すると考え、CSCシグナル伝達を確実にするために表皮成長因子および塩基性線維芽細胞増殖因子を補う。CSCの強固な同定を目指し、機能的評価と表型評価を組み合わせた補完的なアプローチを提案する。球体形成能力、自己更新、および球投影領域は、CSC の機能特性を確立します。さらに、特性評価は、マーカーのフローサイトメトリー評価を含み、CD44+/CD24-およびCD133で表され、ALDHを考慮してウェスタンブロットを含む。提示されたプロトコルは、原発性腫瘍サンプルにも最適化され、サンプル消化手順に従い、翻訳研究に有用であった。
癌集団は異種であり、細胞は異なる形態、増殖および浸潤能力を示し、遺伝子発現の変化による。これらの細胞の中には、自立能力を有する癌幹細胞(CSC)1という名前の少数集団が存在し、原発性腫瘍ニッチの異質性を再現し、恒恒恒転移制御に適切に反応しない異常に分化した前駆体を作り出す2。CSC特性は、腫瘍原性または化学療法に対する耐性などの事象との関連を考えると、臨床現場で直接翻訳することができる3.CSCの同定は、表面マーカーの閉塞、CSC分化の促進、CSCシグナル伝達経路成分の遮断、ニッチ破壊、およびエピジェネティック機構4を含む標的療法の開発につながる可能性がある。
CSCの単離は、細胞ラインおよび原発腫瘍のサンプル5、6、7、8で行われている。CSCについて記載された機能的プロファイルは、クロノ原性、側集団および腫瘍球形成9を含む。CD44高/CD24低表現型は乳房CSCと一貫して関連付けられており、これは生体内で腫瘍形成であることが証明されており、すでに間葉転移5、10に上皮と関連している。高いALDH活性はまた、いくつかのタイプの固形腫瘍11における間葉転移(EMT)に対する茎および上皮と関連している。ALDH発現は、インビトロ12におけるCSC表現型に対する化学療法およびCSC表現型に対する耐性と関連付けられてきたが、13、14、15、16。表1に記載されているように、CD133、CD49f、ITGA6、CD1663、4など、異なるタイプの腫瘍におけるCSC特性にリンクされている他のいくつかのマーカーが挙げられております。
腫瘍球は、CSCの研究と拡張のための3次元モデルで構成されています。このモデルでは、細胞株および血液または腫瘍試料からの細胞懸濁液を、成長因子を添加した培地、すなわち表皮成長因子(EGF)および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)で培養し、ウシ胎児血清および非付着条件下で17。細胞接着の阻害は、分化細胞18のアノイキスによる死をもたらす。球は、分離された細胞のクローン成長から導出されます。この目的のために、細胞は細胞融合および凝集19を避けるために低密度で分布する。別の戦略は、半固体メチルセルロース20の使用を含む。
球体形成プロトコルは、時間とコストと技術的、収益性、および再現可能な理由21、22のためにCSCの分離と拡張で人気を集めました。どの球形成がCSCを反映する程度に関するいくつかの埋蔵量にもかかわらず、天然の微小環境21に似た特徴的な表現型を有する非接着条件で成長する幹細胞の傾向がある。固形腫瘍からのCSCの単離に利用可能な方法のいずれも完全な効率を持っておらず、より具体的なマーカーまたは方法論およびマーカーの組み合わせを開発することの重要性を強調する。
このプロトコルでは、非粘着性条件における単細胞増殖の原理と分化表現型を生成する能力を持つ、球形成プロトコルを用いたCSCの分離について詳述する。この手順の概略図を図1に示します。また、乳房および婦人科腫瘍細胞のラインと原発性腫瘍のサンプルの両方に対するCSCの表面マーカーおよびALDH発現を用いた特性評価についても述べている。
このプロトコルは、がん細胞株および一次ヒトサンプルから腫瘍球を得るためのアプローチを詳述している。腫瘍球は、幹細胞様特性を有するサブ集団に富む36.CSCにおけるこの富化は、分化細胞が基材37への接着に依存している間、アンカレッジフリー環境での生存率に依存する。サスペンションを課す低い付着環境での腫瘍細胞の原発めっきはCSC自身の?…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、2016年の研究賞を通じてポルトガル婦人科学会とCIMAGOによって資金提供されました。Cnc。IBILIは、ポルトガル科学技術財団(UID/NEU/04539/2013)を通じて支援され、FEDER-COMPETE(POCI-01-0145-FEDER-007440)が共同出資しています。CHUCの健康倫理委員会とポルトガル国家データ保護委員会によって承認されたコインブラ病院と大学センター(CHUC)腫瘍銀行は、同機関の婦人科サービスに続く患者の子宮内膜サンプルの供給源でした。図1は、www.servier.comから入手可能なサーヴィエ医療アートを使用して製造された。
Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
DNAse I | Roche | 11284932001 | |
ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
��-actin antibody | Sigma | A5316 |