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Abstract
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Cancer Research

Obtención de esferas de células madre de cáncer de cáncer de tumores ginecológicos y de cáncer de mama

Published: March 01, 2020
doi:
10.3791/60022
, , , , , , ,
1Institute of Biophysics, Faculty of Medicine,University of Coimbra, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), Faculty of Medicine,University of Coimbra, 3CNC.IBILI/Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB),University of Coimbra, 4Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 5Universitary Clinic of Gynecology, Faculty of Medicine,University of Coimbra, 6Gynecology A Service,Coimbra Hospital and Universitary Center, 7Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Faculty of Medicine,University of Coimbra, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine,University of Coimbra, 9Cytometry Operational Management Unit, Clinical Pathology Service,Coimbra Hospital and Universitary Center, 10Polytechnic Institute of Coimbra, ESTESC-Coimbra Health School,Laboratory Biomedical Sciences

Summary

El objetivo de esta metodología es identificar células madre cancerosas (CSC) en líneas celulares cancerosas y muestras de tumores humanos primarios con el protocolo de formación de esferas, de manera robusta, utilizando ensayos funcionales y caracterización fenotípica con citometría de flujo y occidental Blot.

Abstract

Las células madre cancerosas (CSC) son una pequeña población con auto-renovación y plasticidad que son responsables de la tumorigenesis, la resistencia al tratamiento y la enfermedad recurrente. Esta población se puede identificar por marcadores de superficie, actividad enzimática y un perfil funcional. Estos enfoques per se son limitados, debido a la heterogeneidad fenotípica y la plasticidad CSC. Aquí, actualizamos el protocolo de formación de esferas para obtener esferas CSC a partir de cánceres mamarios y ginecológicos, evaluando las propiedades funcionales, los marcadores CSC y la expresión de proteínas. Las esferas se obtienen con sembrado de una sola célula a baja densidad en cultivo de suspensión, utilizando un medio semisólido de metilcelulosa para evitar la migración y los agregados. Este protocolo rentable se puede utilizar en líneas celulares de cáncer, pero también en tumores primarios. El cultivo tridimensional de suspensión no adherente que se cree que imita el microambiente tumoral, particularmente el nicho CSC, se complementa con factor de crecimiento epidérmico y factor de crecimiento básico de fibroblastos para garantizar la señalización de CSC. Con el objetivo de una identificación sólida de la CSC, proponemos un enfoque complementario, que combine la evaluación funcional y fenotípica. La capacidad de formación de esferas, la autorenovación y el área de proyección de esferas establecen propiedades funcionales de CSC. Además, la caracterización comprende la evaluación de la citometría de flujo de los marcadores, representada por CD44+/CD24– y CD133, y Western blot, considerando ALDH. El protocolo presentado también fue optimizado para muestras de tumores primarios, después de un procedimiento de digestión de muestra, útil para la investigación traslacional.

Introduction

Las poblaciones de cáncer son heterogéneas, con células que presentan diferentes morfologías, proliferación y capacidad de invasión, debido a la expresión génica diferencial. Entre estas células, existe una población minoritaria denominada células madre cancerosas (CSC)1, que tienen la capacidad de auto-renovación, recapitulando la heterogeneidad del nicho tumoral primario y produciendo progenitores aberrantes diferenciadores que no responden adecuadamente a los controles homeostáticos2. Las propiedades de CSC se pueden traducir directamente en la práctica clínica, dada la asociación con eventos, como la tumorogenicidad o la resistencia a la quimioterapia3. La identificación de la CSC puede conducir al desarrollo de terapias dirigidas que pueden incluir bloqueo de marcadores superficiales, promoción de la diferenciación de CSC, bloqueo de los componentes de la vía de señalización de CSC, destrucción de nichos y mecanismos epigenéticos4.

El aislamiento de CSC se ha realizado en líneas de células y en muestras de tumores primarios5,6,7,8. El perfil funcional descrito para CSC incluye la capacidad clonogénica, la población lateral y la formación de tumorosfera9. El fenotipobajo CD44alto/CD24 se ha asociado consistentemente con la CSC mamaria, que ha demostrado ser tumorigénico in vivo y ya se ha asociado con la transición epitelial a mesenquimal5,10. La alta actividad de ALDH también se ha asociado con la talloy y la transición epitelial a mesenquimal (EMT) en varios tipos de tumores sólidos11. La expresión ALDH se ha asociado con la resistencia a la quimioterapia y al fenotipo CSC in vitro12,13,14,15,16. Varios otros marcadores se han vinculado a propiedades CSC en diferentes tipos de tumores, como CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 y otros, como se describe en la Tabla 1.

Las tumoresferas consisten en un modelo tridimensional para el estudio y la expansión de la CSC. En este modelo, las suspensiones celulares de las líneas celulares y de muestras de sangre o tumores se cultivan en un medio complementado con factores de crecimiento, a saber, factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF), sin suero bovino fetal y en condiciones no adherentes17. La inhibición de la adhesión celular resulta en la muerte por anoikis de células diferenciadas18. Las esferas se derivan del crecimiento clonal de una célula aislada. Para ello, las celdas se distribuyen a baja densidad para evitar la fusión de celdas y la agregación19. Otra estrategia incluye el uso de metilcelulosa semisólida20.

El protocolo de formación de esferas ganó popularidad en el aislamiento y expansión de CSC, debido al tiempo y costo y razones técnicas, rentables y reproducibles21,22. A pesar de algunas reservas sobre la extensión de la cual la formación de esferas refleja CSC, existe una propensión a que las células madre crezcan en condiciones no adherentes con el fenotipo característico, que se asemeja al microambiente nativo21. Ninguno de los métodos disponibles para el aislamiento de la CSC de los tumores sólidos tiene una eficiencia completa, lo que pone de relieve la importancia de desarrollar marcadores o combinaciones más específicas de metodologías y marcadores.

En este protocolo, detallamos el aislamiento de CSC con el protocolo de formación de esferas, con el principio de crecimiento de una sola célula en condiciones no adherentes y la capacidad de producir un fenotipo diferenciado. En la Figura 1se representa una representación esquemática de este procedimiento. También describimos la caracterización con marcadores de superficie y expresión ALDH para CSC, tanto para líneas de células tumorales mamarias como ginecológicas y muestras de tumores primarios.

Protocol

Este protocolo se realizó cumpliendo con las directrices éticas del Banco de Tumores del Hospital y Centro Universitario de Coimbra (CHUC), y fue aprobado por el Comité de ética de salud de la CHUC y por la Comisión Nacional de Protección de Datos de Portugal. 1. Protocolo de formación de esferas y poblaciones adherentes derivadas de cultivos celulares continuos NOTA: Realice todos los procedimientos bajo estrictas condiciones estériles. Preparaci?…

Representative Results

El protocolo de formación de esferas permite obtener colonias esféricas en suspensión de varias líneas celulares de cáncer de mama y endometriales (Figura 2A) o después de una suave digestión enzimática del tejido a partir de muestras de tumores humanos(Figura 2E). En ambos casos, pocos días después del enchapado, se obtienen colonias esféricas monoclonales en suspensión. Tanto las esferas del endometrio como las de …

Discussion

Este protocolo detalla un enfoque para obtener tumoresferas a partir de líneas celulares cancerosas y muestras humanas primarias. Las tumorferas se enriquecen en una subpoblación con propiedades similares a células madre36. Este enriquecimiento en CSC depende de la viabilidad en un entorno libre de anclaje, mientras que las células diferenciadas dependen de la adhesión a un sustrato37. Como el revestimiento primario de células tumorales en un entorno de baja adherenci…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue financiado por la Sociedad Portuguesa de Ginecología a través del Premio de Investigación 2016 y por CIMAGO. Cnc. IBILI cuenta con el apoyo de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología, Portugal (UID/NEU/04539/2013), y cofinanciado por FEDER-COMPETE (POCI-01-0145-FEDER-007440). El Banco de Tumores del Hospital y Centro Universitario de Coimbra (CHUC), aprobado por el Comité de ética de la Salud de la CHUC y por la Comisión Nacional de Protección de Datos de Portugal, fue la fuente de muestras endometriales de pacientes seguidas en el Servicio de Ginecología de la institución. La Figura 1 fue producida usando Servier Medical Art, disponible en www.servier.com.

Materials

Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
��-actin antibody Sigma A5316
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Laranjo, M., Carvalho, M. J., Serambeque, B., Alves, A., Marto, C. M., Silva, I., Paiva, A., Botelho, M. F. Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors. J. Vis. Exp. (157), e60022, doi:10.3791/60022 (2020).
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