Få kreft stamcellesfærer fra gynekologiske og brystkreft svulster

Summary

Målet med denne metodikken er å identifisere kreftstamceller (CSC) i kreftcellelinjer og primære menneskelige tumorprøver med sfæredannende protokoll, på en robust måte, ved hjelp av funksjonelle analyser og fenotypisk karakterisering med flow cytometri og vestlig Blot.

Abstract

Kreft stamceller (CSC) er en liten befolkning med selvfornyelse og plastisitet som er ansvarlig for tumorigenese, motstand mot behandling og tilbakevendende sykdom. Denne populasjonen kan identifiseres med overflatemarkører, enzymatisk aktivitet og en funksjonell profil. Disse tilnærmingene per se er begrenset, på grunn av fenotypisk heterogenitet og CSC plastisitet. Her oppdaterer vi sfæreformingsprotokollen for å få CSC-kuler fra bryst- og gynekologiske kreftformer, vurdere funksjonelle egenskaper, CSC-markører og proteinuttrykk. Kulene oppnås med encellede seeding ved lav tetthet i suspensjonskultur, ved hjelp av et halvsolid metylcellulosemedium for å unngå migrasjon og aggregater. Denne lønnsomme protokollen kan brukes i kreftcellelinjer, men også i primære svulster. Den tredimensjonale ikke-tilhenger suspensjon kultur antatt å etterligne tumor mikromiljøet, spesielt CSC-nisje, er supplert med epidermal vekstfaktor og grunnleggende fibroblast vekstfaktor for å sikre CSC signalering. Med sikte på robust identifisering av CSC foreslår vi en komplementær tilnærming, som kombinerer funksjonell og fenotypisk evaluering. Sfæredannende kapasitet, selvfornyelseog sfæreprojeksjonsområde etablerer CSC funksjonelle egenskaper. I tillegg består karakterisering av flytcytometri evaluering av markørene, representert ved CD44⁺/CD24^– og CD133, og vestlig blot, vurderer ALDH. Den presenterte protokollen ble også optimalisert for primære tumorprøver, etter en prøvefordøyelsesprosedyre, nyttig for translasjonell forskning.

Introduction

Kreftpopulasjoner er heterogene, med celler som presenterer forskjellige morfologer, spredning og invasjonskapasitet, på grunn av differensialgenuttrykk. Blant disse cellene finnes en minoritetspopulasjon kalt kreftstamceller (CSC)¹, som har kapasitet til selvfornyelse, rekapitulere heterogeniteten til den primære tumornisjen og produserer avvikende differensierende forfedre som ikke reagerer tilstrekkelig på homeostatiske kontroller². CSC egenskaper kan oversettes direkte i klinisk praksis, gitt foreningen med hendelser, som tumorigeniitet eller motstand mot kjemoterapi³. Identifisering av CSC kan føre til utvikling av målrettede terapier som kan omfatte blokkering av overflatemarkører, markedsføring av CSC-differensiering, blokkering av CSC-signalbanekomponenter, nisjeødeleggelse og epigenetiske mekanismer⁴.

Isoleringen av CSC er utført i cellelinjer og i prøver av primære svulster^5,6,7,8. Den funksjonelle profilen som er beskrevet for CSC inkluderer klonogen kapasitet, sidepopulasjon og tumorosfæredannelse⁹. CD44^høy/CD24^lav fenotype har vært konsekvent forbundet med bryst CSC, som har vist seg å være tumorigen in vivo og har allerede vært forbundet med epitel til mesenchymal overgang^5,10. Høy ALDH-aktivitet har også vært forbundet med stemness og epitel til mesenchymal overgang (EMT) i flere typer solide svulster¹¹. ALDH uttrykk har vært forbundet med motstand mot kjemoterapi og csc fenotype in vitro^{12,13,14,15,16}. Flere andre markører har vært knyttet til CSC egenskaper i ulike typer svulster, for eksempel CD133, CD49f, ITGA6, CD166^3,4 og andre, som beskrevet i tabell 1.

Tumorsfærene består av en tredimensjonal modell for studiet og utvidelse av CSC. I denne modellen dyrkes cellesuspensjonene fra cellelinjer og fra blod- eller tumorprøver i et medium supplert med vekstfaktorer, nemlig epidermal vekstfaktor (EGF) og grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF), uten føtal storfe serum og i ikke-tilhengerforhold¹⁷. Hemming av cellevedheft resulterer i død av anoikis av differensierte celler¹⁸. Kuler er avledet fra klonal vekst av en isolert celle. For dette formålet distribueres cellene med lav tetthet for å unngå cellefusjon og aggregasjon¹⁹. En annen strategi inkluderer bruk av semisolid metylcellulose²⁰.

Den sfæredannende protokollen fikk popularitet i CSC isolasjon og ekspansjon, på grunn av tid og kostnader og tekniske, lønnsomme og reproduserbare grunner^21,22. Til tross for noen reserver på omfanget av hvilken sfæredannelse gjenspeiler CSC, er det en tilbøyelighet til stamceller å vokse i ikke-overholdende forhold med den karakteristiske fenotypen, som ligner den opprinnelige mikromiljøet²¹. Ingen av metodene som er tilgjengelige for isolering av CSC fra solide svulster har fullstendig effektivitet, og fremhever viktigheten av å utvikle mer spesifikke markører eller kombinasjoner av metoder og markører.

I denne protokollen beskriver vi isoleringen av CSC med sfæredannende protokoll, med prinsippet om encellet vekst i ikke-etterfølgende forhold og evnen til å produsere en differensiert fenotype. En skjematisk representasjon av denne prosedyren er representert i figur 1. Vi beskriver også karakteriseringen med overflatemarkører og ALDH-uttrykk for CSC, både for bryst- og gynekologiske tumorceller linjer og prøver av primære svulster.

Protocol

Denne protokollen ble utført i samsvar med de etiske retningslinjene til Coimbra Hospital and Universitary Center (CHUC) Tumor Bank, og ble godkjent av CHUCs etikkkomité for helse og av Den portugisiske nasjonale databeskyttelseskommisjonen. 1. Sfæredannende protokoll og avledede tilhengere populasjoner fra kontinuerlige cellekulturer MERK: Utfør alle prosedyrer under strenge sterile forhold. Tilberedning av ikke-tilhengeropphengskulturflasker eller pl…

Representative Results

Den sfæredannende protokollen gjør det mulig å få sfæriske kolonier i suspensjon fra flere endometrie- og brystkreftcellelinjer (figur 2A) eller etter mild enzymatisk fordøyelse av vev fra menneskelige tumorprøver (Figur 2E). I begge tilfeller, noen dager etter plating, oppnås monoklonale sfæriske kolonier i suspensjon. Både endometrie- og brystkreftsfærer gir opphav til en cellemonolayer med lignende morfologi til op…

Discussion

Denne protokollen beskriver en tilnærming for å få tumorsfærer fra kreftcellelinjer og primære menneskelige prøver. Tumorsfærer er beriket i en underpopulasjon med stamcellelignende egenskaper³⁶. Denne berikelsen i CSC er avhengig av levedyktighet i et forankringsfritt miljø, mens differensierte celler er avhengige av vedhende til et substrat³⁷. Som primær plating av tumorceller i et lavt etterlevelse miljø som pålegger suspensjon sikrer ikke berikelse i CSC per …

Materials

Absolute ethanol	Merck Millipore	100983
Accutase	Gibco	A1110501	StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC166362
Annexin V FITC	BD Biosciences	556547
Antibiotic antimycotic solution	Sigma	A5955
BCA assay	Thermo Scientific	23225	Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin	Sigma	A9418
CD133 antibody	Miteny Biotec	293C3-APC	Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody	BD Biosciences	658331	Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody	Biolegend	103020	Pacific Blue (PB)
Cell strainer	BD Falcon	352340	40 µM
Collagenase, type IV	Gibco	17104-019
cOmplete Mini	Roche	118 361 700 0
Dithiothreitol	Sigma	43815
DMEM-F12	Sigma	D8900
DNAse I	Roche	11284932001
ECC-1	ATCC	CRL-2923	Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor	Sigma	E9644
Fibroblast growth factor basic	Sigma	F0291
Haemocytometer	VWR	HERE1080339
HCC1806	ATCC	CRL-2335	Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution	Gibco	41400045
MCF7	ATCC	HTB-22	Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose	AlfaAesar	45490
NaCl	JMGS	37040005002212
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate	Sigma	P3932
Putrescine	Sigma	P7505
RL95-2	ATCC	CRL-1671	Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid	JMS	EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	436143
Tris	JMGS	20360000BP152112
Triton-X 100	Merck	108603
Trypan blue	Sigma	T8154
Trypsin-EDTA	Sigma	T4049
��-actin antibody	Sigma	A5316