Isolement rapide des macrophages de ganglion de racine dorsal
Summary
Ici nous présentons un protocole mécanique de dissociation pour isoler rapidement des macrophages du ganglion de racine dorsal pour le phénotypage et l’analyse fonctionnelle.
Abstract
Il y a des intérêts croissants pour étudier les interactions moléculaires et cellulaires entre les cellules immunitaires et les neurones sensoriels dans les ganglions de racine dorsal après des dommages périphériques de nerf. Les cellules monocytiques périphériques, y compris les macrophages, sont connues pour répondre à une lésion tissulaire par phagocytose, présentation d’antigène, et libération de cytokine. Les preuves émergentes ont impliqué la contribution des macrophages de ganglions de racine dorsale au développement neuropathique de douleur et à la réparation axonale dans le contexte des dommages de nerf. Le phénotypage rapide (ou « isolement rapide de ») la réponse des macrophages de ganglions de racine dorsal dans le contexte des dommages de nerf est désirée pour identifier les facteurs neuroimmuns inconnus. Ici, nous démontrons comment notre laboratoire isole rapidement et efficacement les macrophages des ganglions de racine dorsal à l’aide d’un protocole de dissociation mécanique sans enzymes. Les échantillons sont conservés sur la glace tout au long pour limiter le stress cellulaire. Ce protocole prend beaucoup moins de temps que le protocole enzymatique standard et a été couramment utilisé pour notre analyse de tri cellulaire activée par fluorescence.
Introduction
Il existe maintenant des preuves considérables que les cellules immunitaires contribuent à la douleur neuropathique suite à une lésion nerveuse périphérique1,2. Les cellules monocytiques périphériques, y compris les macrophages mûrs, sont connues pour répondre aux dommages de tissu et à l’infection systémique par la phagocytose, la présentation d’antigène, et la libération de cytokine. Parallèlement à l’activation des microglies induites par les lésions nerveuses dans la corne dorsal spinale, les macrophages dans les ganglions de racine dorsal (DRG) se développent également de manière significative après des dommages de nerf3,4. Notamment, il y a des intérêts croissants pour déterminer si les macrophages contribuent au développement neuropathique de douleur après la blessure périphérique de nerf en interagissant avec des neurones sensoriels dans le DRG5,6,7, 8 Annonces , 9 (en) , 10 Ans et plus , 11. En outre, des études récentes impliquent également la contribution des macrophages de DRG dans la réparation axonale après des dommages de nerf12,13. Une autre étude suggère en outre que les sous-populations de macrophages (c.-à-d. CD11b–Ly6Csalut et CD11b–Ly6Cfaible /- cellules) peuvent jouer un rôle différent dans l’hypersensibilité mécanique14. Par conséquent, le phénotypage rapide de la réponse des macrophages de DRG dans le contexte des dommages de nerf peut nous aider à identifier des facteurs neuroimmuns contribuant à la douleur neuropathique.
Conventionnellement, le protocole pour isoler les macrophages dans le DRG implique plusieurs étapes, y compris la digestion enzymatique15,16. La technique prend souvent beaucoup de temps et peut être coûteuse pour des expériences à grande échelle. Bien que la digestion douce avec le type II de collagène (4 mg/mL) et le type de dispase II (4.7 mg/mL) pendant 20 min ait été recommandée précédemment15,il est concevable que les cellules après l’exposition à cette enzyme soient sujettes aux dommages cellulaires ou à la mort cellulaire, qui peuvent mener à de bas produire. En outre, la différence dans la qualité des enzymes d’un lot à l’autre peut avoir un impact supplémentaire sur l’efficacité de ce processus. Plus important encore, les macrophages exposés à la digestion enzymatique pourraient être stimulés de façon irréprossable et peuvent donc être très différents du statut in vivo. Les changements peuvent potentiellement compliquer les résultats de l’étude fonctionnelle.
Ici nous décrivons un protocole enzyme-libre pour isoler rapidement des macrophages de DRG à 4 oC utilisant la dissociation mécanique. Les échantillons sont conservés sur la glace pour limiter le stress cellulaire. En conséquence, notre approche fournit un avantage pour maintenir la cohérence de l’isolement, et les cellules isolées sont probablement plus saines et moins stimulées. Nous présentons en outre les preuves pour valider la qualité des cellules isolées avec l’analyse de tri cellulaire activée par fluorescence (FACS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous introduisons une nouvelle méthode pour enrichir efficacement les macrophages isolés de la souris DRG. L’approche conventionnelle pour isoler les cellules immunitaires DRG nécessite une digestion enzymatique15,18, qui est maintenant remplacé par l’homogénéisation mécanique dans notre protocole pour limiter les dommages cellulaires indésirables et augmenter le rendement. Par conséquent, le nouveau protocole prend beaucoup moins de temps. Plus imp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’étude a été soutenue par : Foundation for Anesthesia Education and Research (XY); le Département d’anesthésie et de soins périopératoires de l’UCSF (XY); et 1R01NS100801-01(GZ). Cette étude a été appuyée en partie par le Laboratoire d’analyse cellulaire des ressources partagées du CCSDHc grâce à une subvention des NIH (P30CA082103).
Materials
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| a-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
References
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
- Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
- Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778 (2017).
- Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
- Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
- Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
- Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
- Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
- Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
- Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
- Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
- Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
- Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460 (2017).
- Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).
