הבידוד המהיר של הקרופאגים של השורש
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול דיסוציאציה מכנית לבודד מקרופאגים במהירות מתוך גנגליון שורש השורש עבור פנוטיפים וניתוח פונקציונלי.
Abstract
ישנם אינטרסים הגדלים כדי ללמוד את האינטראקציות המולקולריות והסלולר בקרב תאים חיסוניים ונוירונים חושים בתוך גנגליה שורש הגוף לאחר פציעה עצבית היקפית. תאים מונציטוטיים היקפיים, כולל מקרופאגים, ידועים להגיב לפגיעה ברקמה באמצעות phagocyציטוזה, מצגת אנטיגן, ושחרור cy,. ראיות מתעוררים יש מעורב את התרומה של מקרופאגים השורש הדו להתפתחות הכאב נוירופתי ותיקון סיבי בהקשר של פגיעה בעצב. פנוטיפים במהירות (או “בידוד מהיר של”) התגובה של מקרופאגים השורש הדו בהקשר של פגיעה בעצב רצוי לזהות את הגורמים הנוירוחיסוניים לא ידוע. כאן אנו מדגימים כיצד המעבדה שלנו במהירות וביעילות מבודד מקרופאגים מהגנגוליה השורש הגבי באמצעות פרוטוקול דיסוציאציה ללא אנזים מכני. הדגימות נשמרות על הקרח. כדי להגביל את הלחץ התאי פרוטוקול זה הוא הרבה פחות זמן רב בהשוואה לפרוטוקול אנזימטי הסטנדרטי ושימש באופן שגרתי עבור ניתוח מיון התאים שלנו מסוג פלואורסצנטית.
Introduction
יש כעת ראיות רבות כי התאים החיסוניים תורמים לכאב נוירופתי בעקבות פציעת העצב ההיקפי1,2. תאים היקפיים, כולל מקרופאגים בוגרים, ידועים כתגובה לפגיעה ברקמות ולזיהום מערכתי באמצעות phagocyציטוזה, מצגת אנטיגן, ושחרור cyטוקין. מקבילים נזק עצבי המושרה מיקרוגלייה הפעלה בקרן השדרה, מקרופאגים ב גרעינים שורש השורש (drg) גם להרחיבבאופן משמעותי לאחר פגיעהבעצב 3,4. במיוחד, ישנם האינטרסים גוברת כדי לקבוע אם המקרופאגים תורמים להתפתחות כאב נוירופתי לאחר פגיעה בעצב היקפי על ידי אינטראקציה עם נוירונים חושים ב drg5,6,7, בן שמונה , מיכל בן 10 , מיכל עשור , 11. יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה גם לסבך את התרומה של מקרופאגים drg בתיקון סיבי לאחר פציעה העצב12,13. עוד מחקר מציע כי מקרופאג תת אוכלוסיות (כלומר, CD11b+Ly6Chi CD11b+Ly6Cנמוך/ תאים) עשוי לשחק תפקיד אחר ברגישות יתר מכני14. לכן, פנוטיפים במהירות את התגובה של מקרופאגים DRG בהקשר של פגיעה בעצב עשוי לעזור לנו לזהות גורמים נוירוחיסוניים התורמים לכאבים נוירופתיים.
מקובל, הפרוטוקול לבודד מקרופאגים ב-drg כרוך בשלבים מרובים כולל עיכול אנזימטי15,16. הטכניקה היא לעתים קרובות זמן רב והוא יכול להיות יקר עבור ניסויים בקנה מידה גדול. למרות העיכול מתון עם קולגן הסוג השני (4 מ”ג/mL) ו dispase סוג II (4.7 mg/mL) עבור 20 דקות היה מומלץ בעבר15, זה אפשרי כי תאים לאחר החשיפה אנזים זה נוטים לנזק לתאים או מוות התא, אשר עשוי להוביל נמוך תשואה. בנוסף, ההפרש באיכות האנזימים מאצווה לאצווה עלול להשפיע עוד יותר על היעילות של תהליך זה. חשוב מכך, מקרופאגים שנחשפו לעיכול האנזים עשוי להיות גירוי בלתי צפוי, וכך יכול להיות מאוד שונה מהמצב in-vivo. השינויים עשויים לסבך את תוצאת המחקר הפונקציונלי.
כאן נתאר פרוטוקול ללא אנזים כדי לבודד במהירות DRG מקרופאגים ב-4 ° c באמצעות דיסוציאציה מכנית. הדגימות נשמרות בקרח. כדי להגביל את הלחץ התאי כתוצאה מכך, הגישה שלנו מספקת יתרון כדי לשמור על עקביות של הבידוד, ואת התאים הבודדים הם ככל הנראה בריאים יותר מגורה פחות. אנחנו עוד להציג את הראיות כדי לאמת את האיכות של תאים מבודדים עם מיון המופעל באמצעות תאים פלואורסצנטית (FACS).
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציגים שיטה חדשה ביעילות להעשיר מקרופאגים מבודדים מ DRG העכבר. הגישה המקובלת לבודד התאים החיסוניים drg דורש עיכול אנזימטית15,18, אשר מוחלף כעת עם המגון מכני בפרוטוקול שלנו כדי להגביל את הנזק הסלולרי בלתי רצוי ולהגדיל את התשואה. לכן, הפרוטוקול החדש הוא הר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר נתמך על ידי: הקרן לחינוך הרדמה ומחקר (XY); המחלקה לטיפול בהרדמה מרבית (XY); ו-1R01NS100801-01 (GZ). מחקר זה היה נתמך בחלקו על ידי HDFCCC המעבדה לניתוח תא משאבים משותפים באמצעות מענק NIH (P30CA082103).
Materials
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| a-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
References
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
- Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
- Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778 (2017).
- Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
- Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
- Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
- Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
- Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
- Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
- Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
- Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
- Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
- Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460 (2017).
- Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).
