Isolamento rapido dei macrofagi di Ganglion dorsale
Summary
Qui presentiamo un protocollo di dissociazione meccanica per isolare rapidamente i macrofagi dal ganglio della radice dorsale per la fenotipizzazione e l’analisi funzionale.
Abstract
Ci sono crescenti interessi per studiare le interazioni molecolari e cellulari tra le cellule immunitarie e neuroni sensoriali nei gangli della radice dorsale dopo la lesione del nervo periferico. Le cellule monocitiche periferiche, compresi i macrofagi, sono note per rispondere a una lesione tissutale attraverso la fagocitosi, la presentazione dell’antigene e il rilascio di citochine. Prove emergenti hanno implicato il contributo dei macrofagi dei gangli della radice dorsale allo sviluppo del dolore neuropatico e alla riparazione assonale nel contesto di lesioni nervose. Si desidera che la fenotipizzazione rapida (o “isolamento rapido”) la risposta dei macrofagi dei gangli della radice dorsale nel contesto della lesione nervosa sia desiderata per identificare i fattori neuroimmuni sconosciuti. Qui dimostriamo come il nostro laboratorio isola rapidamente ed efficacemente i macrofagi dai gangli della radice dorsale utilizzando un protocollo di dissociazione meccanica privo di enzimi. I campioni sono conservati sul ghiaccio per tutto il massimo per limitare lo stress cellulare. Questo protocollo richiede molto meno tempo rispetto al protocollo enzimatico standard ed è stato regolarmente utilizzato per la nostra analisi di ordinamento cellulare attivata dalla fluorescenza.
Introduction
Ora ci sono notevoli prove che le cellule immunitarie contribuiscono al dolore neuropatico a seguito di lesioni nervose periferiche1,2. Le cellule monocitiche periferiche, compresi i macrofagi maturi, sono note per rispondere alle lesioni ai tessuti e all’infezione sistemica attraverso la fagocitosi, la presentazione dell’antigene e il rilascio di citochine. Parallelamente all’attivazione di microglia indotta da lesioni nervose nel corno spinale, i macrofagi nei gangli della radice dorsale (DRG) si espandono in modo significativo dopo la lesione nervosa3,4. In particolare, ci sono crescenti interessi per determinare se i macrofagi contribuiscono allo sviluppo del dolore neuropatico dopo la lesione del nervo periferico interagendo con i neuroni sensoriali nel DRG5,6,7 8 (IN vio , 9 (in vie , 10 del sistema , 11.Inoltre, studi recenti implicano anche il contributo dei macrofagi DRG nella riparazione assonale dopo lesioni nervose12,13. Un altro studio suggerisce inoltre che le sottopopolazioni di macrofagi (ad es. CD11b–Ly6Chi e CD11b–Ly6Clow/- cells) possono svolgere un ruolo diverso nell’ipersensibilità meccanica14. Pertanto, la rapida fenotipizzazione della risposta dei macrofagi DRG nel contesto di lesioni nervose può aiutarci a identificare i fattori neuroimmuni che contribuiscono al dolore neuropatico.
Convenzionalmente, il protocollo per isolare i macrofagi nel DRG prevede più passaggi tra cui la digestione ezimatica15,16. La tecnica richiede spesso molto tempo e può essere costosa per gli esperimenti su larga scala. Anche se la digestione lieve con collagenase di tipo II (4 mg/mL) e dispase tipo II (4,7 mg/mL) per 20 min è stato raccomandato in precedenza15, è possibile che le cellule dopo l’esposizione a questo enzima siano soggette a danni alle cellule o morte cellulare, che possono portare a fruttare. Inoltre, la differenza nella qualità degli enzimi da lotto a lotto può influire ulteriormente sull’efficienza di questo processo. Ancora più importante, i macrofagi esposti alla digestione enzimatica potrebbero essere stimolati indesiderabilmente e quindi possono essere molto diversi dallo stato in vivo. I cambiamenti possono complicare potenzialmente l’esito dello studio funzionale.
Qui descriviamo un protocollo privo di enzimi per isolare rapidamente i macrofagi DRG a 4 gradi centigradi usando la dissociazione meccanica. I campioni sono tenuti sul ghiaccio per limitare lo stress cellulare. Di conseguenza, il nostro approccio offre un vantaggio per mantenere la coerenza dell’isolamento, e le cellule isolate sono presumibilmente più sane e meno stimolate. Presentiamo inoltre le prove per convalidare la qualità delle cellule isolate con l’analisi FACS (Fluorescence-activated Cell Sorting).
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui introduciamo un nuovo metodo per arricchire efficacemente i macrofagi isolati dal mouse DRG. L’approccio convenzionale per isolare le cellule immunitarie DRG richiede la digestione ezimatica15,18, che è ora sostituita con l’omogeneizzazione meccanica nel nostro protocollo per limitare i danni alle cellule indesiderate e aumentare la resa. Pertanto, il nuovo protocollo richiede molto meno tempo. Ancora più importante, la digestione enzimatica potrebbe stimol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è stato sostenuto da: Fondazione per l’anestesia Istruzione e ricerca (XY); il Dipartimento di Anestesia e Cura Perioperatoria dell’UCSF (XY); e 1R01NS100801-01(G). Questo studio è stato sostenuto in parte da HDFCCC Laboratory for Cell Analysis Shared Resources Facility attraverso una sovvenzione del NIH (P30CA082103).
Materials
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| a-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
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