डोर्सल रूट गंडिका मैक्रोफेज का तेजी से अलगाव
Summary
यहाँ हम phenotyping और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए पृष्ठीय जड़ गुच्छिका से मैक्रोफेज को तेजी से अलग करने के लिए एक यांत्रिक वियोजन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
परिधीय तंत्रिका चोट के बाद पृष्ठीय जड़ Ganglia में प्रतिरक्षा कोशिकाओं और संवेदी न्यूरॉन्स के बीच आणविक और सेलुलर बातचीत का अध्ययन करने के लिए हितों बढ़ रहे हैं. परिधीय मोनोसाइटिक कोशिकाओं, मैक्रोफेज सहित, phagocytosis के माध्यम से एक ऊतक की चोट का जवाब करने के लिए जाना जाता है, प्रतिजन प्रस्तुति, और साइटोकिन रिलीज. उभरते सबूत तंत्रिका चोट के संदर्भ में neuropathic दर्द के विकास और axonal मरम्मत करने के लिए पृष्ठीय जड़ Ganglia मैक्रोफेज के योगदान को फंसाया है. तेजी से phenotyping (या “की तीव्र अलगाव”) तंत्रिका चोट के संदर्भ में पृष्ठीय जड़ ganglia मैक्रोफेज की प्रतिक्रिया अज्ञात neuroimmune कारकों की पहचान करने के लिए वांछित है. यहाँ हम प्रदर्शित कैसे हमारी प्रयोगशाला तेजी से और प्रभावी ढंग से एक एंजाइम मुक्त यांत्रिक वियोजन प्रोटोकॉल का उपयोग कर पृष्ठीय जड़ Ganglia से मैक्रोफेज अलग. नमूने सेलुलर तनाव को सीमित करने के लिए भर में बर्फ पर रखा जाता है. यह प्रोटोकॉल मानक एंजाइमी प्रोटोकॉल की तुलना में अभी तक कम समय लेने वाला है और नियमित रूप से हमारे फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है।
Introduction
अब इस बात के काफी प्रमाण हैं कि परिधीय तंत्रिका की चोट1,2के बाद प्रतिरक्षा कोशिकाएं तंत्रिकारोग दर्द में योगदान करती हैं . परिपक्व मैक्रोफेज सहित परिधीय मोनोसाइटिक कोशिकाओं, phagocytosis, प्रतिजन प्रस्तुति, और साइटोकिन रिलीज के माध्यम से ऊतक चोट और प्रणालीगत संक्रमण का जवाब करने के लिए जाना जाता है। रीढ़ की हड्डी में तंत्रिका चोट प्रेरित माइक्रोग्लिया सक्रियण के समानांतर, पृष्ठीय जड़ गैंगेलिया (डीआरजी) में मैक्रोफेज भी तंत्रिका चोट3,4के बाद काफी विस्तार करते हैं। विशेष रूप से, वहाँ बढ़ रहे हितों को निर्धारित करने के लिए अगर मैक्रोफेज DRG5,6,7में संवेदी न्यूरॉन्स के साथ बातचीत से परिधीय तंत्रिका चोट के बाद neuropathic दर्द के विकास के लिए योगदान कर रहे हैं, 8 , 9 , 10 , 11इसके अलावा , हाल के अध्ययनों से तंत्रिका की चोट12,13के बाद एक्सोनल मरम्मत में डी आर जी मैक्रोफेज के योगदान को भी शामिल किया गया है . एक अन्य अध्ययन से यह भी पता चलता है कि मैक्रोफेज उपजनसंख्या (यानी, CD11b+Ly6Chi और CD11b+Ly6Cकम/ इसलिए, तंत्रिका चोट के संदर्भ में डीआरजी मैक्रोफेज की प्रतिक्रिया को तेजी से फीनोटाइपिंग करने से हमें न्यूरोम्यून्योरन कारकों की पहचान करने में मदद मिल सकती है जो न्यूरोपैथिक दर्द में योगदान देते हैं।
पारंपरिक रूप से, डीआरजी में मैक्रोफेज को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल में एंजाइमी पाचन15,16सहित कई कदम शामिल हैं . तकनीक अक्सर समय लगता है और बड़े पैमाने पर प्रयोगों के लिए महंगा हो सकता है. हालांकि कोलैनाज़ प्रकार द्वितीय (4 mg/mL) और dispase प्रकार द्वितीय (4.7 mg/mL) के लिए हल्के पाचन पहले की सिफारिश की थी15, यह माना जाता है कि इस एंजाइम के लिए जोखिम के बाद कोशिकाओं को नुकसान या सेल मौत के लिए प्रवण हैं, जो कम करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं उपज. इसके अलावा, बैच से बैच के लिए एंजाइमों की गुणवत्ता में अंतर आगे इस प्रक्रिया की दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं. इससे भी महत्वपूर्ण बात, एंजाइम पाचन के संपर्क में मैक्रोफेज undesirably प्रेरित किया जा सकता है और इस तरह में-vivo स्थिति से बहुत अलग हो सकता है. परिवर्तन संभावित कार्यात्मक अध्ययन के परिणाम जटिल हो सकता है.
यहाँ हम यांत्रिक वियोजन का उपयोग करते हुए 4 डिग्री सेल्सियस पर DRG मैक्रोफेज को तेजी से अलग करने के लिए एक एंजाइम मुक्त प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। नमूनों को सेलुलर तनाव को सीमित करने के लिए बर्फ पर रखा जाता है। एक परिणाम के रूप में, हमारे दृष्टिकोण अलगाव की स्थिरता बनाए रखने के लिए एक लाभ प्रदान करता है, और अलग कोशिकाओं संभवतः स्वस्थ और कम प्रेरित कर रहे हैं. हम आगे फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) विश्लेषण के साथ अलग कोशिकाओं की गुणवत्ता को मान्य करने के लिए सबूत पेश करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम प्रभावी ढंग से माउस DRG से अलग मैक्रोफेज को समृद्ध करने के लिए एक नई विधि परिचय. DRG प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण एंजाइमी पाचन की आवश्यकता15,18, जो अब…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अध्ययन द्वारा समर्थित किया गया था: संज्ञाहरण शिक्षा और अनुसंधान के लिए फाउंडेशन (XY); संज्ञाहरण और पेरिऑपरेटिव केयर (XY) के UCSF विभाग; और 1R01NS100801-01(जीजेड).। इस अध्ययन के भाग में NIH (P30CA082103) से एक अनुदान के माध्यम से सेल विश्लेषण साझा संसाधन सुविधा के लिए HDFCCC प्रयोगशाला द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| a-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
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