Rask isolering av rygg rot Ganglion makrofager
Summary
Her presenterer vi en mekanisk dissosiasjon protokoll for raskt å isolere makrofager fra rygg rot Ganglion for bestemmelse av fenotype og funksjonell analyse.
Abstract
Det er økende interesser for å studere molekylær og cellulære interaksjoner mellom immunceller og sensoriske neurons i rygg roten ganglia etter perifer nerveskader. Perifere monocyttisk celler, inkludert makrofager, er kjent for å svare på en vevsskade gjennom fagocytose, antigenpresentasjon, og cytokin utgivelse. Emerging bevis har innblandet bidraget av rygg rot ganglia makrofager å nevropatisk smerte utvikling og axonal reparasjon i sammenheng med nerveskade. Raskt bestemmelse av fenotype (eller “rask isolering av”) responsen av rygg rot ganglia makrofager i sammenheng med nerveskader er ønskelig å identifisere de ukjente neuroimmune faktorene. Her viser vi hvordan laboratoriet vårt raskt og effektivt isolerer makrofager fra rygg roten ganglia ved hjelp av en enzym fri mekanisk dissosiasjon protokoll. Prøvene er holdt på isen hele å begrense mobilnettet stress. Denne protokollen er langt mindre tidkrevende i forhold til standard enzymatisk protokollen og har blitt rutinemessig brukt for vår fluorescens-aktivert Cell sortering analyse.
Introduction
Det er nå betydelige bevis for at immunceller bidrar til nevropatisk smerte etter perifer nerveskader1,2. Perifere monocyttisk celler, inkludert modne makrofager, er kjent for å svare på vevskader og systemisk infeksjon gjennom fagocytose, antigenpresentasjon, og cytokin utgivelse. Parallelt nerve skaden-indusert mikroglia i spinal rygg Hornet, makrofager i rygg roten ganglia (DRG) utvides også betraktelig etter nerveskade3,4. Spesielt er det økende interesser for å avgjøre om makrofager bidrar til nevropatisk smerte utvikling etter perifer nerveskader ved å samhandle med sensoriske neurons i DRG5,6,7, 8 på alle , 9 andre priser , 10 andre , 11. Videre har nyere studier også implisere bidraget fra DRG makrofager i axonal reparasjon etter nerveskader12,13. En annen studie antyder videre at macrophage subpopulasjoner (dvs. CD11b+Ly6CHi og CD11b+Ly6Clav/- celler) kan spille en annen rolle i den mekaniske overfølsomhet14. Derfor raskt bestemmelse av fenotype respons av DRG makrofager i sammenheng med nerveskader kan hjelpe oss med å identifisere neuroimmune faktorer som bidrar til nevropatisk smerte.
Konvensjonelt, protokollen for å isolere makrofager i DRG innebærer flere trinn inkludert enzymatisk fordøyelse15,16. Teknikken er ofte tidkrevende og kan være kostbart for store eksperimenter. Selv om mild fordøyelse med kollagenase type II (4 mg/mL) og dispase type II (4,7 mg/mL) i 20 min ble anbefalt tidligere15, er det tenkelig at cellene etter eksponering for dette enzymet er utsatt for celle skade eller celle død, noe som kan føre til lav Gi. I tillegg kan forskjellen i kvaliteten på enzymer fra batch til batch ytterligere påvirke effektiviteten av denne prosessen. Enda viktigere, makrofager eksponert for enzymet fordøyelsen kan være uønsket stimulert og dermed kan være svært forskjellig fra in-vivo-status. Endringene kan potensielt komplisere utfallet av den funksjonelle studien.
Her beskriver vi en enzym fri protokoll for raskt å isolere DRG makrofager ved 4 ° c ved hjelp av mekaniske dissosiasjon. Prøvene er holdt på isen for å begrense mobilnettet stress. Som et resultat av vår tilnærming gir en fordel å opprettholde konsistens av isolasjonen, og de isolerte cellene er antagelig sunnere og mindre stimulert. Vi presenterer ytterligere bevis for å validere kvaliteten på de isolerte cellene med fluorescens-aktivert Cell sortering (FACS) analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her introduserer vi en ny metode for å effektivt berike isolerte makrofager fra mus DRG. Den konvensjonelle tilnærmingen til å isolere DRG immunceller krever enzymatisk fordøyelse15,18, som nå er erstattet med mekanisk homogenisering i vår protokoll for å begrense uønsket celle skade og øke avkastningen. Den nye protokollen er derfor langt mindre tidkrevende. Enda viktigere, kan enzym fordøyelsen stimulere makrofager og endre molekylær signatur. I kont…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien ble støttet av: Foundation for anestesi utdanning og forskning (XY); den UCSF Department of anestesi og Perioperativ Care (XY); og 1R01NS100801-01 (GZ). Denne studien ble støttet delvis av HDFCCC laboratorium for Cell analyse delte ressurser Facility gjennom en bevilgning fra NIH (P30CA082103).
Materials
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| a-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
References
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
- Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
- Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778 (2017).
- Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
- Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
- Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
- Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
- Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
- Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
- Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
- Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
- Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
- Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460 (2017).
- Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).
