Améliorer la précision de l'évaluation cytométrique du débit du potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre grâce à l'inhibition des pompes d'Efflux
Summary
Les pompes à efflux xénobiotiques sont très actives dans les cellules hématopoïétiques des tiges et des progéniteurs (HSPC) et provoquent l’extrusion de TMRM, un colorant fluorescent potentiel de membrane mitochondriale. Ici, nous présentons un protocole pour mesurer avec précision le potentiel de membrane mitochondriale dans HSPCs par TMRM en présence de Verapamil, un inhibiteur de pompe d’efflux.
Abstract
Comme le métabolisme cellulaire est un régulateur clé de l’auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques (HSC), les divers rôles joués par les mitochondries dans l’homéostasie hématopoïétique ont été largement étudiés par les chercheurs de HSC. Les niveaux d’activité mitochondriale sont reflétés dans leurs potentiels membranaires, qui peuvent être mesurés par des colorants cationic à perméatifs tels que TMRM (tetramethylrhodamine, ester méthyle). La capacité des pompes d’efflux pour extruder ces colorants des cellules peut limiter leur utilité, cependant. Le biais de mesure qui en résulte est particulièrement critique lors de l’évaluation des HSC, car les transporteurs xénobiotiques présentent des niveaux d’expression et d’activité plus élevés dans les HSC que dans les cellules différenciées. Ici, nous décrivons un protocole utilisant Verapamil, un inhibiteur de pompe d’efflux, pour mesurer avec précision le m à travers les populations multiples de moelle. L’inhibition résultante de l’activité de pompe est montrée pour augmenter l’intensité de TMRM dans les cellules hématopoïétiques de tige et d’ancêtre (HSPc), tout en la laissant relativement inchangée dans les fractions mûres. Cela met en évidence l’attention particulière à l’activité de teinture-efflux qui est nécessaire lorsque les colorants dépendants de l’état d’œil sont utilisés, et comme écrit et visualisé, ce protocole peut être utilisé pour comparer avec précision soit différentes populations au sein de la moelle osseuse, ou la même population différents modèles expérimentaux.
Introduction
Les cellules souches hématopoïétiques (HSC) sont auto-renouvelantes, multipotentes, et capables de donner naissance à toutes les cellules du sang1,2. Le métabolisme cellulaire est un régulateur clé de la maintenance HSC, avec des facteurs transcriptionnels, des signaux intrinsèques et le microenvironnement3,4,5. Le contrôle approprié de la fonction et de la qualité mitochondriales est donc essentiel à l’entretien de HSC6,7.
Le potentiel de la membrane mitochondriale est un paramètre clé dans l’évaluation des mitochondries car il reflète directement leur fonctionnalité, qui découle de l’équilibre de l’activité de pompage des protons dans la chaîne de transport d’électrons et du flux de protons à travers F 1/FO ATP synthase. Ceux-ci sont tous deux nécessaires (selon l’expression des gènes et la disponibilité du substrat) pour la phosphorylation dépendante de l’oxygène d’ADP à L’ATP8,9. Profitant de l’électronégativité du compartiment mitochondrial, divers colorants potentialométriques ont été développés pour mesurer l’amon. L’un d’eux est la tétramethylrhodamine méthylester perchlorate (TMRM), qui a été largement utilisé pour mesurer la cytométrie de flux dans une variété de cellules10, y compris les cellules hématopoïétiques tige et progénitrice11.
Les colorants mitochondriaux doivent être utilisés avec une certaine prudence dans les HSC, cependant, parce que la forte activité des pompes à efflux xénobiotiques de ces cellules peut entraîner l’extrusion de colorant12. En effet, l’extrusion de colorants mitochondriaux tels que Rhodamine 123 a permis aux chercheurs d’isoler les HSC13 ou d’identifier les « populations secondaires » du HSC en exploitant l’extrusion différentielle des teintures Hoechst Blue et Hoechst Red14, 15. Il a également été démontré que fumitremorgin E, un bloqueur spécifique du transporteur de la sous-famille G (ABCG2) de la cassette liant l’ATP, n’affecte pas le modèle de coloration de MitoTracker dans les HSPC16. Après la publication de ces résultats, de multiples études ont été réalisées à l’aide de colorants mitochondriaux en l’absence d’inhibiteurs de la pompe à efflux xénobiotiques, ce qui a donné l’impression répandue que les HSC n’ont qu’un petit nombre de mitochondries à faible niveau16. , 17 Annonces , 18.
Récemment, il a été démontré, cependant, que Verapamil, un inhibiteur à large spectre des pompes d’efflux, modifie de manière significative le modèle de coloration du colorant mitochondrial MitoTracker Vert19. Cet écart est probablement dû au fait que fumitremorgin E est très sélectif pour Abcg2, tandis que les HSC expriment également d’autres transporteurs tels que Abcb1a (qui n’est que faiblement sensible à Fumitremorgin C)19. Nous avons également signalé que d’autres colorants mitochondriaux, tels que TMRM, Nonyl acridine orange, et Mitotracker Orange (MTO) présentent les mêmes modèles que Mitotracker Green. Plus important encore, nous avons observé que les modèles cytométriques de flux des HSPC reflètent leur ‘m en plus de la masse mitochondriale11.
La prise de colorant TMRM dépend strictement de la charge négative des mitochondries, mais l’accumulation résultante de colorant est en équilibre constant entre sa prise et le dégagement par des pompes d’efflux20. La différence dans l’expression de pompe d’efflux xénobiotique entre HSCs et populations matures de cellules affecte cet équilibre et peut mener aux résultats biaisés. L’utilisation d’inhibiteurs dédiés tels que Verapamil devrait être prise en compte dans l’analyse de l”amon par les colorants potentialométriques. Ici, nous décrivons un protocole modifié pour la mesure précise de l’écoulement par TMRM qui corrige l’activité du transporteur xénobiotique grâce à l’utilisation d’inhibiteurs dédiés.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mesure potentielle de membrane mitochondriale est une pierre angulaire de l’analyse et de l’évaluation des mitochondries, qui sont critiques à l’état métabolique de la cellule. Ici, nous décrivons un protocole pour l’analyse de la coloration de ‘m par TMRM. TMRM est un colorant fluorescent à permeant cellulaire qui s’accumule dans les mitochondries actives en raison de l’Am, et ses niveaux respectifs restent en équilibre entre les compartiments extracellulaires, cytoplasmiques et mitochondriaux<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient tous les membres du laboratoire Ito, en particulier K Ito et H Sato, et l’Einstein Stem Cell Institute pour les commentaires et les installations de base Einstein Flow Cytometry and Analytical Imaging (financé par la subvention P30 CA013330 du National Cancer Institute) pour aider à réaliser les expériences. K.I. est soutenu par des subventions des National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577, et R01DK100689) et du New York State Department of Health en tant que directeur principal de la génomique monocellulaire/épigénomique d’Einstein (C029154). K.I. Ito est chercheur à la Leukemia and Lymphoma Society.
Materials
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
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