에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상
Summary
Xenobiotic efflux 펌프는 조혈 줄기와 전구 세포 (HSPC)에서 매우 활성화되어 미토콘드리아 막 잠재적 형광 염료인 TMRM의 압출을 유발합니다. 여기서, 우리는 유출 펌프 억제제인 Verapamil의 존재 에 있는 TMRM에 의하여 HSPC에 있는 미토콘드리아 막 전위를 정확하게 측정하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
세포 대사가 조혈 줄기 세포 (HSC) 자기 갱신의 중요한 레귤레이터이기 때문에, 조혈 항상성에서 미토콘드리아가 하는 다양한 역할은 HSC 연구원에 의해 광범위하게 연구되었습니다. 미토콘드리아 활성 수준은 TMRM(테트라메틸라호다민, 메틸 에스테르)과 같은 세포-식양이온염료로 측정할 수 있는 막 전위(ΔΘm)에 반영됩니다. 그러나 세포에서 이러한 염료를 돌출하는 유출 펌프의 능력은 그 유용성을 제한할 수 있습니다. xenobiotic 수송기는 분화한 세포에서 보다는 HSC에 있는 발현 그리고 활동의 상부를 전시하기 때문에 결과 측정 편향은 HSC를 평가할 때 특히 중요합니다. 여기에서는 여러 골수 집단에서 ΔΘm을 정확하게 측정하기 위해 유출 펌프 억제제인 Verapamil을 활용하는 프로토콜을 설명합니다. 펌프 활동의 결과 억제는 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPC)에서 TMRM 강도를 증가시키는 것으로 나타났으며 성숙한 분획에서 상대적으로 변하지 않은 채로 남습니다. 이것은 ΔΘm 의존염료가 사용될 때 요구되는 염료-유출 활동에 주의를 강조하고, 서면 및 시각화될 때, 이 프로토콜은 골수 내의 다른 인구, 또는 동일 인구를 정확하게 비교하기 위하여 이용될 수 있습니다 다양한 실험 모델에 걸쳐.
Introduction
조혈 줄기 세포 (HSC)는 자가 갱신, 다중 강력하며 혈액의 모든 세포를 발생시킬 수있습니다 1,2. 세포 대사는 전사 인자, 본질적인 신호 및 미세 환경3,4,5와함께 HSC 유지 보수의 주요 조절제입니다. 따라서 미토콘드리아 기능 및 품질의 적절한 제어는HSC 유지 보수 6,7에매우 중요합니다.
미토콘드리아 멤브레인 전위(ΔΘm)는 미토콘드리아의 기능을 직접 반영하기 때문에 미토콘드리아의 평가에서 핵심 적인 매개 변수이며, 이는 전자 수송 사슬에서 양성자 펌핑 활성의 평형과 F를 통한 양성자 흐름에서 파생됩니다. 1/FO ATP 신디사이저. 이들은 모두 ATP8,9에대한 ADP의 산소 의존성 인산화에 대해 (유전자 발현 및 기질 가용성에 따라 다름)이 요구된다. 미토콘드리아 구획의 전기적 성전성을 활용하여, ΔΘm을 측정하기 위해 다양한 전위성 염료가 개발되었습니다. 그 중 하나는 테트라메틸호다민 메틸에스테르 과염소산염(TMRM)으로, 이는 조혈줄기 및 전구세포(11)를포함하는 다양한 세포에서 유세포분석에 의해 ΔΔm을 측정하는데 광범위하게 사용되고 있다.
미토콘드리아 염료는 이러한 세포의 엑세바이오틱 액피펌프의 높은 활성이 염료 압출(12)을 초래할 수 있기때문에, HSC에서 몇 가지 주의를 기울여 사용해야 한다. 실제로, 로다민 123과 같은 미토콘드리아 염료의 압출은 연구원이 HSCs13을 격리하거나 염료 Hoechst Blue 및 Hoechst Red14의 차동 압출을 이루에 의해 HSC “측군수”를 식별할 수 있게 해 주었습니다. 도 15. 또한 FUmitremorgin C, ATP 결합 카세트 하위 패밀리 G 부재 2 (ABCG2) 수송의 특정 차단제, HSPC16에서미토 트래커의 염색 패턴에 영향을미치지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과의 출판 후, 여러 연구는 xenobiotic 유출 펌프 억제제의 부재에 미토콘드리아 염료를 사용하여 수행되었다, HSC는 낮은 Δm 16미토콘드리아의 소수만 가지고 있다는 광범위한 인상으로 이어지는 , 17세 , 18.
그러나 최근에는, 프럭스 펌프의 광범위한 스펙트럼 억제제인 베라파밀이 미토콘드리아 염료 미토트래커 그린(MitoTracker Green)의 염색 패턴을 현저하게 수정한다는 것이 입증되었다. 이러한 불일치는 Fumitremorgin C가 Abcg2에 대해 매우 선택적이라는 사실 로 인한 것일 수 있으며, HSC는 또한 Abcb1a (Fumitremorgin C에 약하게 민감함)와 같은 다른 운송업체를 표현합니다19. 우리는 또한 다른 미토 콘 드리 아 염 염 염, TMRM 등, Nonyl 아크리딘 오렌지, 그리고 미토 트래커 오렌지 (MTO) 미토 트래커 그린과 동일한 패턴을 전시. 더 중요한 것은, 우리는 HSPC의 유동 세포 측정 패턴이 미토콘드리아 질량11이외에 그들의 ΔΘm을 반영한다는 것을 관찰했습니다.
TMRM 염료의 섭취는 엄격하게 미토콘드리아의 음전하에 따라 달라지지만, 그 결과 로 인한 염료 축적은 efflux 펌프20에의한 섭취와 클리어런스 사이의 일정한 균형입니다. HSC와 성숙한 세포 집단 사이의 xenobiotic 유출 펌프 발현의 차이는 이 균형에 영향을 미치고 편향된 결과로 이끌어 낼 수 있습니다. Verapamil과 같은 전용 억제제의 사용은 전위성 염료에 의한 ΔΘm의 분석에서 고려되어야 합니다. 여기에서 우리는 전용 억제제의 사용을 통해 xenobiotic 수송기 활동을 정정하는 TMRM 기지를 둔 유량 세포측정에 의하여 정확한 ΔΘm 측정을 위한 수정된 프로토콜을 기술합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
미토콘드리아 막 전위 측정은 세포의 대사 상태에 중요한 미토콘드리아의 분석 그리고 평가의 초석입니다. 여기서, TMRM 염색에 의한 ΔΘm의 분석을 위한 프로토콜을 설명한다. TMRM은 ΔΘm으로 인해 활성 미토콘드리아에 축적되는 세포-천형형 염료이며, 각각의 수준은 세포외, 세포질 및 미토콘드리아구획(10)사이의 평형 상태로 유지된다. 이 프로토콜은 테트라메틸호다민, 에틸 에…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 이토 실험실의 모든 구성원을 감사, 특히 K 이토와 H 사토, 의견과 아인슈타인 흐름 세포 분석 및 분석 이미징 핵심 시설에 대한 아인슈타인 줄기 세포 연구소 (국립 암 연구소 보조금 P30 CA013330)에 대한 실험을 수행하는 데 도움이됩니다. K.I.는 아인슈타인 단세포 유전체학/후성유전체학(C029154)의 핵심 이사로서 국립보건원(R01DK98263, R01DK115577 및 R01DK100689)과 뉴욕 주 보건부의 보조금으로 지원됩니다. K.I. 이토는 백혈병과 림프종 학회의 연구 학자입니다.
Materials
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
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