Efflux pompaları Inhibisyonu Ile hematopoetik kök ve progenitor hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin akış Cytometrik değerlendirilmesi doğruluğu iyileştirilmesi
Summary
Xenobiotic “effluks” pompalar son derece hematopoetik kök ve progenitör hücreleri (hspcs) ve neden ekstrüzyon TMRM, bir mitokondriyal membran potansiyel floresan boya aktif. Burada, bir “effluks” pompa inhibitörü verapamil varlığında TMRM tarafından hspcs ‘de mitokondriyal membran potansiyelini doğru ölçmek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Hücresel metabolizma hematopoetik kök hücre (HSC) Self-yenileme, hematopoetik homeostaz mitokondri tarafından oynanan çeşitli roller önemli bir düzenleyici olduğu gibi kapsamlı HSC araştırmacılar tarafından incelendi. Mitokondriyal aktivite seviyeleri, TMRM (tetrametilrhodamin, metil ester) gibi hücre-perdemek kyonik boyalar ile ölçülecek olan membran potansiyelleri (Δkr m) ile yansıtılır. Bu boyalar hücrelerden ekstrüze etmek için “effluks” pompaları yeteneği, ancak kullanışlılığı sınırlandırabilirsiniz. Ksenobotik taşıyıcılar, HSCs ‘de farklılaşmış hücrelerden daha yüksek ifade ve etkinlik sergileyen, HSCs ‘yi değerlendirirken elde edilen ölçüm önyargı özellikle önemlidir. Burada, bir “effluks” pompa inhibitörü olan verapamil ‘i kullanarak, birden fazla kemik iliği nüfusu arasında δkr m ‘i doğru şekilde ölçmek için bir protokol açıklanmaktadır. Pompa aktivitesinin ortaya çıkan inhibisyonu, hematopoetik kök ve Progenitör hücrelerde TMRM yoğunluğunu artırmak için gösterilir (hspcs), Olgun fraksiyonları nispeten değişmeden bırakarak iken. Bu, Δkr m ‘ye bağımlı boyalar kullanıldığında ve yazılmış ve görselleştirildiğinde gerekli olan boya-efflux aktivitesine yakın ilgi vurgulamaktadır, bu protokol kemik iliği içindeki farklı nüfus ya da aynı nüfus içinde doğru karşılaştırmak için kullanılabilir farklı deneysel modeller arasında.
Introduction
Hematopoetik kök hücreler (HSCs) kendi kendini yenileyen, çok güçlü ve kan1,2tüm hücrelere artış veren yeteneğine sahiptir. Hücresel metabolizma HSC bakım, transkripsiyon faktörleri, içsel sinyaller ve mikroçevre3,4,5ile birlikte önemli bir düzenleyici olduğunu. Mitokondriyal fonksiyon ve kalitenin uygun kontrolü bu nedenle HSC bakım6,7için önemlidir.
Mitokondriyal membran potansiyeli (Δkr m), doğrudan işlevselliğini yansıtan mitokondri değerlendirilmesinde anahtar bir parametredir, bu da elektron taşıma zincirindeki proton pompalama aktivitesinin dengesinden ve F üzerinden proton akışına göre türemiştir. 1/FO ATP synthase. Bu her ikisi de (gen ifadesi ve substrat kullanılabilirliği bağlı olarak) ADP, ATP için oksijen bağımlı fosforilasyon için8,9gereklidir. Mitokondriyal bölmesinin elektronik aletinden faydalanabilmek için Δkr m ‘i ölçmek üzere çeşitli Potansiyometrik boyalar geliştirilmiştir. Bunlardan biri tetrametylrhodamine metil ester perklorat (TMRM), hangi yaygın hücreler çeşitli akış sitometri tarafından δkr m ölçmek için kullanılan10, hematopoetik kök ve progenitör hücreler dahil11.
Ancak, bu hücrelerin ksenobiyotik “effluks” pompaları yüksek aktivite boya ekstrüzyon12neden olabilir çünkü mitokondriyal boyalar, HSCs bazı dikkatli kullanılması gerekir. Nitekim, Rhodamine 123 gibi mitokondriyal boyaların ekstrüzyon araştırmacılar HSCs izole etmek için izin verdi13 veya HSC tanımlamak “yan nüfus” boya Hoechst mavi ve Hoechst kırmızı14diferansiyel ekstrüzyon sömürüyor tarafından, 15. aynı zamanda bu Fumitremorgin C, ATP-bağlayıcı kaset alt aile G üyesi 2 (ABCG2) taşıyıcı, belirli bir engelleyici, HSPCs16mitotracker boyama deseni etkilemez gösterildi. Bu sonuçların yayınlanması sonrasında, ksenobiyotik “effluks” pompa inhibitörlerinin yokluğunda mitokondrial boyalar kullanılarak birden fazla çalışma gerçekleştirildi, HSCs ‘nin düşük δkr m16 ile sadece az sayıda mitokondri sahip olduğu yaygın izlenimi taşımaktadır. , 17 , 18 yaşınakadar.
Son zamanlarda, ancak, bu verapamil, “effluks” pompaları geniş bir spektrum inhibitörü, önemli ölçüde mitokondriyal boya mitotracker yeşil19boyama deseni değiştirir gösterildi. Bu tutarsızlık muhtemelen Fumitremorgin C ‘nin Abcg2 için son derece seçici olması nedeniyle, HSCs Ayrıca Abcb1a gibi diğer taşıyıcıları da ifade ederken (sadece Fumitremorgin C ‘ye zayıf hassastır)19. Ayrıca, TMRM, nonyl akridin Orange ve mitotracker Orange (MTO) gibi diğer mitokondrial boyaların mitotracker Green ile aynı desenleri sergilediğine dair rapor verdik. Daha da önemlisi, HSPCs ‘in akış cytometrik desenlerinin, mitokondriyal kütle11‘ e ek olarak Δkr m ‘lerini yansıttığını gözlemledik.
TMRM boya alımı kesinlikle mitokondri negatif şarj bağlıdır, ancak boya elde edilen birikim, alımı ve boşluğu arasında sürekli bir denge ile “effluks” pompalar20. HSCs ve olgun hücre nüfusu arasındaki ksenobiyotik “effluks” pompa ifadesinde fark bu dengeyi etkiler ve önyargılı sonuçlara yol açabilir. Verapamil gibi özel inhibitörlerinin kullanımı, Potansiyometrik boyalar ile Δkr m analizinde düşünülebilir. Burada, özel inhibitörler kullanılarak ksenobiyotik ışınlama aktivitesini düzeltir olan TMRM tabanlı Akış sitometrisi ile doğru δkr m ölçümü için değiştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondriyal membran potansiyel ölçümü, hücrenin metabolik durumu için kritik olan mitokondri analizinin ve değerlendirmesinin temel taşıdır. Burada, TMRM staining tarafından Δkr m analizi için bir protokol açıklanmaktadır. TMRM, Δkr m nedeniyle aktif mitokondri içinde biriken ve ilgili seviyeleri, ekstrüler, sitoplazmik ve mitokondriyal bölmeleri10arasında denge içinde kalır bir hücre-perdemek floresan boya. Bu protokol tetrametilrhodamin, etil ester (TMRE) ve JC-1 gibi ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Ito laboratuar, özellikle K Ito ve H sato ve Einstein kök hücre Enstitüsü yorum ve Einstein Flow cytometry ve analitik görüntüleme çekirdek tesisleri (Ulusal Kanser Enstitüsü Grant P30 CA013330 tarafından finanse edilen) tüm üyelerine teşekkür deneyler yürütmek yardımcı olur. K.I. Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01DK98263, R01DK115577 ve R01DK100689) ve Einstein tek hücreli Genomics/Epigenomics (C029154) çekirdek Direktörü olarak sağlık New York Dışişleri Bakanlığı hibe tarafından desteklenir. K.I. Ito lösemi ve lenfoma toplumu araştırma bilimci olduğunu.
Materials
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
- Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Wilson, A., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine. Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).
- Ito, K., Bonora, M., Ito, K. Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate. International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).
- Ito, K., et al. Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance. Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).
- Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
- Walker, J. E. The regulation of catalysis in ATP synthase. Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).
- Spangrude, G. J., Johnson, G. R. Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).
- Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, 13125 (2016).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury. Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel. The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
