Summary
Xenobiotic oval utstrømming pumper er svært aktive i blodkreft stem og stamceller (HSPCs) og forårsake ekstrudering av TMRM, en mitokondrie membran potensial fluorescerende fargestoff. Her presenterer vi en protokoll for å nøyaktig måle mitokondrie membran potensial i HSPCs av TMRM i nærvær av Verapamil, en utstrømming pumpe inhibitor.
Abstract
Som cellulær metabolisme er en nøkkel regulator av blodkreft stilk cellen (HSC) selv-fornyelse, de ulike rollene spilt av mitokondrier i blodkreft homeostase har blitt grundig studert ved HSC forskere. Mitokondrie aktivitet nivåer gjenspeiles i deres membran potensialer (ΔΨm), som kan måles ved celle-permeant kationiske fargestoffer som TMRM (tetramethylrhodamine, metyl Ester). Muligheten for utstrømming pumper å extrude disse fargestoffer fra celler kan begrense nytten, men. Den resulterende målingen bias er spesielt kritisk når vurdere HSCs, som xenobiotic oval transportører viser høyere nivåer av uttrykk og aktivitet i HSCs enn i differensiert celler. Her beskriver vi en protokoll som bruker Verapamil, en utstrømming pumpe inhibitor, for å nøyaktig måle ΔΨm på tvers av flere benmarg populasjoner. Den resulterende hemming av pumpen aktivitet er vist å øke TMRM intensitet i blodkreft stilk og stamceller (HSPCs), mens du forlater det relativt uendret i modne fraksjoner. Dette fremhever den nære oppmerksomheten til Dye-utstrømming aktivitet som er nødvendig når ΔΨm-avhengige fargestoffer brukes, og som skrevet og visualisere, denne protokollen kan brukes til å nøyaktig sammenligne enten ulike populasjoner i benmargen, eller samme befolkning på tvers av ulike eksperimentelle modeller.
Introduction
Blodkreft stamceller (HSCs) er selv fornye, multi-potente, og i stand til å gi opphav til alle cellene i blodet1,2. Cellular metabolisme er en nøkkel regulator av HSC vedlikehold, sammen med transcriptional faktorer, indre signaler og mikromiljøet3,4,5. Riktig kontroll av mitokondrie funksjon og kvalitet er derfor avgjørende for HSC vedlikehold6,7.
Mitokondrie membran potensial (ΔΨm) er en viktig parameter i vurderingen av mitokondrier som det direkte reflekterer deres funksjonalitet, som stammer fra likevekt av Proton pumping aktivitet i elektron transport kjeden og Proton strømme gjennom F 1/FO ATP-syntase. Dette er både nødvendig (avhengig av genuttrykk og substrat tilgjengelighet) for oksygen avhengige fosforylering av ADP til ATP8,9. Dra nytte av elektronegativitet av mitokondrie kupé, har ulike potensiometrisk fargestoffer er utviklet for å måle ΔΨm. En av dem er tetramethylrhodamine metyl Ester perklorat (TMRM), som har vært mye brukt til å måle ΔΨm ved flyt flowcytometri i en rekke celler10, inkludert blodkreft stammen og stamceller11.
Mitokondrie fargestoffer må brukes med en viss forsiktighet i HSCs, men fordi den høye aktiviteten av xenobiotic oval utstrømming pumper av disse cellene kan resultere i fargestoff ekstrudering12. Faktisk er ekstrudering av mitokondrie fargestoffer som Rhodamine 123 tillot forskerne å isolere HSCs13 eller identifisere HSC "side populasjoner" ved å utnytte differensial ekstrudering av fargestoffer Hoechst blå og Hoechst rød14, 15. det har også blitt vist at Fumitremorgin C, en bestemt blokkering av den ATP-binding kassett sub-familien G medlem 2 (ABCG2) transportør, ikke påvirker farging mønster av MitoTracker i HSPCs16. Etter utgivelsen av disse resultatene, ble flere studier utført ved hjelp av mitokondrie fargestoffer i fravær av xenobiotic oval utstrømming pumpe hemmere, fører til utbredt inntrykk av at HSCs har bare et lite antall mitokondrier med lav ΔΨm16 , 17 i , 18 i år.
Nylig ble det demonstrert, men at Verapamil, et bredt spekter inhibitor av utstrømming pumper, endrer farge mønster av mitokondrie fargestoff MitoTracker Green19. Dette avviket skyldes sannsynligvis det faktum at Fumitremorgin C er svært selektiv for Abcg2, mens HSCs også uttrykker andre transportører som Abcb1a (som bare er svakt følsomme for Fumitremorgin C)19. Vi har også rapportert at andre mitokondrie fargestoffer, som TMRM, Nonyl Akridin oransje, og Mitotracker Orange (MTO) viser de samme mønstrene som Mitotracker Green. Enda viktigere, vi har observert at flyten analytiske mønstre av HSPCs reflekterer deres ΔΨm i tillegg til mitokondrie masse11.
Inntak av TMRM fargestoff avhenger strengt på den negative belastningen av mitokondrier, men den resulterende akkumulering av fargestoff er i konstant balanse mellom inntak og klaring ved utstrømming pumper20. Forskjellen i xenobiotic oval utstrømming pumpe uttrykk mellom HSCs og modne celle populasjoner påvirker denne balansen, og kan føre til partisk resultater. Bruk av dedikerte hemmere som Verapamil bør vurderes i analysen av ΔΨm av potensiometrisk fargestoffer. Her beskriver vi en modifisert protokoll for nøyaktig ΔΨm-måling ved TMRM-baserte strømnings flowcytometri som korrigerer for xenobiotic oval transporter aktivitet gjennom bruk av dedikerte hemmere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Albert Einstein College of Medicine.
1. utarbeidelse av løsninger
- Farging buffer (fosfat-bufret saltvann (PBS) + 2% fosterets storfe serum (FBS)): tilsett 10 mL FBS i 500 mL av en steril PBS-løsning.
Merk: Denne løsningen kan oppbevares ved 4 ° c i minst en måned i steril tilstand. Før du starter følgende prosedyrer, sette en alikvot av denne løsningen (50 mL) på isen. - ACK (ammonium-klorid-kalium) lysering buffer: Plasser en alikvot av ACK lysering buffer (1 mL) på is før du starter prosedyren.
Merk: For å forberede den samme ikke-kommersielle buffer, oppløse 8,02 g av NH4CL, 1 g KHCO3 og 37,2 mg av na2EDTA i 1 L av H2O. Juster pH til 7.2-7.4. Oppbevares i opptil 6 måneder ved romtemperatur. - Kultur medium: tilsett 50 ng/mL Stamcelle faktor (SCF) og 50 ng/mL thrombopoietin (TPO) til serum fritt medium for kultur og utvidelse av blodkreft celler (se tabell over materiale for kommersielt medium anbefales).
- TMRM lagerløsning: klargjør TMRM-oppløsning (1 μM) ved å oppløse 5 mikrogram TMRM pulver i 10 mL etanol. Oppbevar denne løsningen ved-20 ° c beskyttet mot lyset.
- Verapamil lagerløsning: Forbered Verapamil (50 mM) oppløsning ved å fortynne 24 mg Verapamil i 1 mL etanol. Oppbevar denne løsningen ved-20 ° c.
- FCCP lagerløsning: Forbered carbonilcyanide p-triflouromethoxyphenylhydrazone (FCCP) (1 M) løsning ved å oppløse 254 mg i 1 mL etanol. Oppbevar denne løsningen ved-20 ° c beskyttet mot lyset.
2. benmarg isolasjon
- Euthanize musen ved CO2 inhalasjon følgende institusjonelle retningslinjer og spray musene med 70% etanol.
Merk: Dette trinnet hindrer forurensning av cellene av interesse uten å kompromittere eksperimentelle resultater. - Ved hjelp av et par tang og skarp saks, lage et lite klipp i ventrale huden og strekke huden.
- Pakk femur og Tibia mens du tar vare ikke å løsne hodene på femur som de inneholder en stor mengde benmargceller. Plasser de fjernede beina i en 6-brønn plate fylt med 1,5 mL farge buffer.
Merk: Denne fremgangsmåten krever ikke sterilt område. - Fjern musklene fra beina og kutt endene av beina slik at avkjørselen av benmargen (figur 1a). Plasser de rene beina i nye brønner med 1,5 mL farge buffer.
Merk: Muskler og annet vev må fjernes forsiktig for å unngå tilstopping av sprøyter i neste trinn. - Skyll benmargen med en 3 mL sprøyte med en 25 G nål.
Merk: Fortsett å skylle benmargen til benet blir hvitt (figur 1B). - Samle alle cellene i en 1,5 mL rør, sentrifuge i 5 min ved 180 x g deretter forkaste Supernatanten (figur 1C).
- Resuspend pellet i 300 μL av iskald ACK lysering buffer veldig nøye, satt på isen i 1 min og umiddelbart inaktive lyse ved å legge 1 mL farge buffer. Sentrifuger for 5 min ved 180 x g.
Merk: Celle pellet vises hvit (figur 1d). Totalt antall celler som er isolert, er omtrent 2-4 x 107. - Resuspend pellets i 1 mL farge buffer og filter ved hjelp av en celle-sil cap (12 x 75 mm2,5 ml kapasitet) med en 35 μm nylon mesh innlemmet for å oppnå mononukleære celler. Etter blokkering, holde prøven på isen.
3. Immunostaining for påvisning av HSC
- Forbered Lineage (Lin) cocktail. I 400 μL av farge buffer, tilsett 4 μL av følgende biotinilated antistoffer mot CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, NK 1.1, IgM og Il7Ra å få en endelig fortynning 1:100.
- Forbered fluorophores bøyd-antistoffer (ABS). I 400 til μL av farge buffer, tilsett 4 μL av følgende ABS for å få en endelig fortynning 1:100. Streptavidin-Pacific Blue, Sca1-PE/Cy7, c-Kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/CY 5.5 og CD34-FITC. Oppbevares i is, beskyttet mot lys.
- Sentrifuger prøven i 5 min ved 180 x g, og kast deretter supernatanten.
- Tilsett 400 μL av lin cocktail løsning til cellene pellet. Tilsett 4 μL av CD135-biotinilated AB. Vortex raskt å mikse og ruge i 30 min i isen.
- Vask prøven og Legg til 3 mL farge buffer, spinn ned i 5 min ved 180 x g og kast supernatanten.
- Tilsett 400 μL av ABS-løsning. Vortex raskt å mikse og ruge i 30 minutter på isen.
- Vask prøvene med 3 mL farge buffer, spinn ned i 5 min ved 180 x g og kast supernatanten.
4. TMRM farging
- Forbered TMRM farge løsning. Tilsett 2,2 μL av TMRM lagerløsning og 1,1 μL av Verapamil (2 nM og 50 μM som endelig konsentrasjon, henholdsvis) i 1,1 mL serum fritt medium for kultur og utvidelse av blodkreft celler (se tabell over materiale for kommersielt medium anbefales) med TPO og SCF.
Merk: Dette er det viktigste trinnet i protokollen. Verapamil tillegg er nødvendig for å blokkere utstrømming pumper som er svært uttrykt i HSCs og kan extrude TMRM. - Resuspend benmargen i 1 mL TMRM farge løsning, Vortex raskt og ruge for 1 time ved 37 ° c.
Merk: TMRM farging må ikke vaskes ut. PE-dedikert kompensasjons kontroll er også resuspendert 100 μL av TMRM farge løsning, og utsettes for inkubasjons for 1 time ved 37 ° c etter rask Vortex. - Filter prøven ved hjelp av en celle-sil cap (12 x 75mm 2,5 ml kapasitet) med en 35 μm nylon mesh innarbeidet for å unngå tilstopping av strømnings flowcytometer.
Merk: TMRM farging øker muligheten for tette dannelse i prøven. Filtrering av prøven rett før strømnings analyser anbefales. - Tilsett 1 μL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) for å ekskludere døde celler ved å flyte flowcytometri.
5. oppkjøp av Flow Flowcytometer
- Kjør benmarg prøve og erverve minst 1 x 106 hendelser.
-
Sett opp gating strategi for å identifisere de ulike blodkreft populasjoner (figur 2).
- Vis Live benmarg mono-Atom celler (BM-MNCs), DAPI− brøk, i plott for Pacific Blue for å identifisere CD135−Lin− (Lin−) og Lin+ brøker.
- Plot Lin− brøk for APC/Cy7 (c-Kit) versus PE/Cy7 (SCA-1) å identifisere Multipotent FORFEDRE (MPP) brøkdel, som c-Kit+ og SCA-1+.
- Plot MPP brøk for APC (CD48) versus PerCP/CY 5.5 (CD150) for å identifisere HSC brøk, som CD150+ og CD48−.
- Utfoldelse HSC brøk for FITC (CD34) å dividere CD34−-HSC og CD34+-HSC.
- Skaff deg TMRM intensitet (PE-kanal) i hver populasjon.
- Etter oppkjøpet, legge til prøven 1 μL av FCCP å oppnå den endelige konsentrasjonen av 1 mM og ruge ved 37 ° c i 5 min, og deretter erverve 1 x 106 hendelser.
Merk: FCCP er en mitokondrie uncoupler som brukes til å spre ΔΨm. Den brukes som eksperimentell kontroll for å bekrefte at TMRM farging fungerer riktig. Etter administrering av FCCP bør TMRM-intensiteten drastisk reduseres (figur 3a). - Analyser data som normaliserer den gjennomsnittlige intensiteten til PE for hver populasjon av intensiteten til PE i alle BM-MNCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen som er beskrevet ovenfor, gjør det enkelt å isolering av BM-MNCs fra en musemodell. Figur 1 oppsummerer de viktigste trinnene i protokollen: bein isolasjon, Flushing ut av benmargen, røde blodlegemer lyse, og antistoff flekker ETTERFULGT av TMRM farging for å måle mitokondrie membran potensial i en bestemt blodkreft befolkning .
BM-MNCs inneholder flere celle populasjoner, inkludert HSCs. Antistoff cocktails som brukes i denne protokollen er godt etablert i rensing av HSCs (CD34− og CD34+), Multipotent stamceller (MPPs), Lin− samt Lin+ celler, henholdsvis 21. Den gating strategien for å isolere disse fraksjonene er vist i figur 2.
Etter identifisering av populasjoner av interesse, TMRM intensitet, som skal vises som en lys signal, ble vurdert. TMRM farging i serum fritt ekspansjon medium (SFEM) er sterkt anbefalt, som TMRM profiler i HSPCs kan gjennomgå endring når farging er utført i PBS + 2% FBS (figur 3a).
Figur 3c viser gjennomsnittlig intensitet for hver populasjon, som er normalisert av INTENSITETEN i BM-MNCs. HSCs uttrykke høy aktivitet nivåer av xenobiotic oval utstrømming pumper i stand til ekstrudering TMRM fargestoff20, og faktisk fant vi TMRM profiler i HSPCs ble endret i nærvær av Verapamil (figur 3b, C). Lignende resultater ble innhentet av andre hemmere som Ciklosporin H (figur 3c). Dermed kan den nøyaktige mengden TMRM som er lastet i mitokondrier av ΔΨm måles etter hemming av de utstrømming pumpene ved Verapamil eller Ciklosporin H (figur 3c).
Til slutt kan FCCP brukes til å verifisere nøyaktigheten av TMRM farging. FCCP depolarizes mitokondrier, noe som resulterer i en reduksjon i TMRM intensitet (figur 3D). Denne tilnærmingen kan også brukes til å bestemme bakgrunnen intensiteten av farging og/eller som en negativ kontroll.
Figur 1: protokoll flytskjema. Grafisk sammendrag av prosedyren for å isolere og beis BM-MNCs for å avgjøre ΔΨm. Kritiske trinn utheves av bilde innsettinger (A-D). Femurs og tibias fra voksen C57BL/6 mus ble isolert og deres ender er fjernet (A). Lange bein som i A etter flush Out (B). Isolert BM-MNCs før (C) og etter (D) ACK lyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: gating oppsett. Skjematisk fremstilling av gating strategi for å identifisere de ulike blodkreft populasjoner, inkludert CD34−-HSC og CD34+-HSC, MPP, Lin− og Lin+ Cells. Panelene ble modifisert fra Bonora, M. et al.11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Flow flowcytometri analyse av mitokondrie membran potensial. (A) representativ fordeling av ΔΨm i HSCs BEISET med TMRM i PBS + 2% FBS (grønn) eller i serum fri utvidelse medium (SFEM) (rød). (B, C) Representativ fordeling av ΔΨm i CD34−-HSC og Lin− celler (B) og kvantifisering av ΔΨm i CD34−-HSC, CD34+-HSC, MPP, Lin− og Lin+ celler (C) beiset med TMRM i nærvær eller fravær av utstrømming pumpe hemmere. TMRM intensitet av hver befolkning ble normalisert av TMRM intensitet egen BM-MNCs (modifisert fra Bonora, M. et al.11). (D) representative histogram for TMRM intensitet fordeling i HSCs før (rosa) og etter (lyseblå) FCCP tillegg. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondrie membran potensielle målingen er en hjørnestein i analyse og vurdering av mitokondrier, som er avgjørende for metabolsk tilstand av cellen. Her beskriver vi en protokoll for analyse av ΔΨm ved TMRM farging. TMRM er et celle-permeant fluorescerende fargestoff som akkumuleres i aktiv mitokondrier på grunn av ΔΨm, og de respektive nivåene forblir i likevekt mellom ekstracellulære, cytoplasmatiske og mitokondrie rom10. Denne protokollen kan tilpasses for ulike fargestoffer, inkludert tetramethylrhodamine, etanol Ester (TMRE) og JC-1. Egnede flekker forhold er avgjørende for å oppnå nøyaktige resultater. Disse inkluderer: beskyttelse mot lys eksponering, riktig inkubasjonstid, vedlikehold av konstant temperatur (37 ° c) og ekstracellulære konsentrasjon. Når TMRM Dye høyder ha ikke ennå nådd perfekt likevekt, uventede endre inne flekk intensiteten kan oppdaget i løpet av data oppkjøpet inne flyten flowcytometri forarbeide. Derfor er den anbefalte farge perioden for TMRM 1 t i stedet for 30 min (som nevnt i en TMRM-produsentens protokoll). Det er også antydet at prøven skal anskaffes minst to ganger i løpet av 5-min for å sammenligne stabiliteten av fargestoff.
Et annet kritisk trinn i protokollen er å sette opp en effektiv farge match blant antistoffer og fargestoff. Blodkreft populasjoner kan oppdages ved flyt flowcytometri bruker godt etablerte overflaten markører21. Den gating strategien beskrevet her (figur 2) er kompatibel med TMRM farging, og gir mulighet for måling av sin intensitet på ulike differensiering stadier samtidig. TMRM matcher PE-kanalen, men intensiteten er vanligvis mye svakere enn antistoffer som bøyes likt med PE (data ikke vist). Siden dette kan påvirke farge kompensasjonen, noe som fører til uventede skift i Spectra av noen populasjoner, bør prøven med TMRM-farging brukes som en kompensasjons kontroll for PE-kanalen.
Den store fordelen med den nåværende protokollen er at den muliggjør fjerning av effekten av xenobiotic oval utstrømming pumper, som effektiv ekstrudering av TMRM fargestoff modifiserer både sin likevekt over plasma membranen og dens mitokondrie akkumulering. Dette er et kritisk skritt i nøyaktig vurdering av HSC mitokondrie funksjon av fargestoff absorpsjon. Som HSCs Express mer aktive utstrømming pumper enn begått celler19, Verapamil eller lignende stoffer, slik som Ciklosporin H, en ca2 +-uavhengig multidrug motstand inhibitor22 (figur 3b-C), bør brukes i farging prosedyre for HSCs å mer nøyaktig vurdere nivåer av mitokondrie aktivitet. Fordi dette kritiske problemet ble påpekt bare nylig11,19 og er fortsatt under diskusjon23, Hovedformålet med denne rapporten er å gi en enkel og detaljert protokoll som vil bidra til å standardisere prosedyren for innhenting av reproduserbar data og redusere de åpenbare avvikene mellom resultatene av ulike forskningsgrupper. Protokollen her beskrevet viser i detalj hvert trinn, inkludert doser, timing og spesifikke medier. TMRM-profiler i HSPCs kan for eksempel variere avhengig av medium (figur 3a). En detaljert analyse av mekanismene involvert vil kreve videre leting, men siden serum fri ekspansjon medium (SFEM) er en veletablert metode for HSC kultur, SFEM stedet PBS er sterkt anbefalt når du utfører TMRM farging for HSCs. Videre, nøyaktig vurdering av mitokondrie membran potensialet demonstrert her gjennom hemming av utstrømming pumper fremhever mulige fremtidige anvendelser av Verapamil, så vel som andre fargestoffer (f. eks MitoTracker, MitoSOX), i etterforskningen av HSCs.
Betydelig, TMRM intensiteten idet vist av flyte flowcytometri kanskje ikke akkurat reflektere mitokondrie kvantum. Flow flowcytometri måler total fluorescens intensitet per celle, men fordelingen av mitokondrie fargestoffer til mitokondrier avhenger av ΔΨm. Det er derfor vanskelig å skjelne om det kritiske bidraget til en TMRM-avlesning stammer fra ΔΨm eller mitokondrie volum11. Vi har bekreftet at MTO, en av fargestoffer oftest brukt til å måle mitokondrie masse, påvirkes av både ΔΨm og utstrømming pumpe aktivitet. Vi har også observert at Verapamil endrer intensiteten profilen til MTO i HSPC populasjoner, men har funnet noen sammenheng mellom MTO intensitet og mitokondrie volum11. Kombinert måling av mitokondrie volum og ΔΨm bør brukes til å normalisere data og eliminere virkningene av membran potensial, og videre utforskning av mitokondrie innhold bør utføres ved hjelp av ΔΨm-uavhengige teknikker.
Slike teknikker vil inkludere 3D-volum analyse basert på fluorescerende markører (f. eks, immunostaining av mitokondrie proteiner), elektron mikroskopi11, og kvantifisering av mitokondrie/kjernefysiske DNA prosenter. Bruken av mitokondrie fargestoffer (dvs. TMRM) i kombinasjon med utstrømming system hemmere vil utvilsomt vise seg stor nytte i elucidation av mitokondrie biologi gjennom flyt flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker alle medlemmer av Ito laboratorium, spesielt K Ito og H Sato, og Einstein Stem Cell Institute for kommentarer og Einstein Flow flowcytometri og Analytical Imaging kjerne anlegg (finansiert av National Cancer Institute Grant P30 CA013330) for hjelp til å utføre eksperimentene. K.I. støttes av tilskudd fra National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577, og R01DK100689) og New York State Department of Health som Core Director of Einstein single-Cell Genomics/Epigenomics (C029154). K.I. Ito er en forsknings forsker av leukemi og lymfom Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1 mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
- Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Wilson, A., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine. Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).
- Ito, K., Bonora, M., Ito, K. Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate. International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).
- Ito, K., et al. Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance. Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).
- Bonora, M., et al.
- Walker, J. E. The regulation of catalysis in ATP synthase. Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).
- Spangrude, G. J., Johnson, G. R. Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).
- Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, 13125 (2016).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury. Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel. The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
