طريقة الكهربائي في الجسم الحيوي تسليم الحمض النووي بلازميد في Telencephalon حمار وحشي الكبار
Summary
المعروضة هنا هي طريقة الكهربائي لتسليم الحمض النووي بلازميد وتسمية الخلايا ependymoglial في telencephalon حمار وحشي الكبار. هذا البروتوكول هو وسيلة سريعة وفعالة لتصور وتتبع الخلايا الأيبندية الفردية ويفتح إمكانيات جديدة لتطبيق الكهربائي على مجموعة واسعة من التلاعبات الوراثية.
Abstract
الكهربائي هو طريقة التغوط التي يتم فيها تطبيق حقل كهربائي على الخلايا لخلق المسام المؤقتة في غشاء الخلية وزيادة نفاذية، مما يسمح لجزيئات مختلفة ليتم إدخالها إلى الخلية. في هذه الورقة، يتم استخدام الكهربائي لإدخال بلازميدات إلى الخلايا الاستئصالية، والتي خط المنطقة البطينية من الدماغ حمار وحشي الكبار. جزء من هذه الخلايا يظهر خصائص الخلايا الجذعية ويولد الخلايا العصبية الجديدة في الدماغ حمار وحشي. لذلك، دراسة سلوكهم أمر ضروري لتحديد أدوارهم في تكوين الأعصاب وتجديدها. إدخال بلازميدات عن طريق الكهربائي يتيح وضع العلامات على المدى الطويل وتتبع خلية واحدة ependymoglial. وعلاوة على ذلك، يمكن تسليم البلازميدات مثل Cre recombinase أو Cas9 إلى خلايا ependymoglial واحدة، والتي تمكن من إعادة تركيب الجينات أو تحرير الجينات ويوفر فرصة فريدة لتقييم وظيفة الجينات المستقلة للخلية في السيطرة عليها، الطبيعية البيئه. وأخيراً، يتم استخدام هذا البروتوكول الكهربائي المفصل خطوة بخطوة للحصول على إدخال ناجح للبلازميدات في عدد كبير من الخلايا الاستئصالية واحدة.
Introduction
حمار وحشي هي نماذج حيوانية ممتازة لفحص تجديد الدماغ بعد إصابة جرح طعنة. بالمقارنة مع الثدييات، على سلم التطور، والأنواع الأقل تطورا مثل حمار وحشي تظهر عموما معدلات أعلى من تكوين الأعصاب التأسيسية والمناطق الأوسع من سكن الخلايا الجذعية العصبية الكبار، مما يؤدي إلى توليد مستمر من الخلايا العصبية الجديدة في جميع أنحاء معظم مناطق الدماغ في حياة الكبار. ويبدو أن هذه الميزة ترتبط مع قدرة تجديدية أعلى بكثير من حمار وحشي بالمقارنة مع الثدييات1، كما حمار وحشي لديها إمكانات ملحوظة لتوليد الخلايا العصبية الجديدة بكفاءة في معظم نماذج إصابات الدماغ درس2، 3,4,5,6,7,8. هنا، يتم دراسة telencephalon سمك الحمار الوحشي، لأنها منطقة الدماغ مع تكوين الأعصاب بارزة في مرحلة البلوغ. هذه المناطق من تكوين الأعصاب الكبار هي متجانسة للمناطق العصبية في الدماغ الثدييات الكبار9،10،11.
المناطق العصبية وفيرة في telencephalon حمار وحشي موجودة بسبب وجود glia شعاعي مثل الخلايا أو خلايا ependymoglia. الخلايا الاستئصالية Ependymoglial بمثابة الخلايا الجذعية العصبية الكبار المقيمين ومسؤولة عن توليد الخلايا العصبية الجديدة في كل من الدماغ سليمة وتجديد3،5. وقد أظهرت تجارب تتبع النسب أن ependymoglia البطينية تتفاعل مع الإصابة، ثم تنتشر وتوليد الخلايا العصبية الجديدة التي تهاجر إلى موقع الآفة5. بسبب الطبيعة المتتربدة من الدماغ حمار وحشي، الخلايا ependymoglial خط السطح البطيني وبناء الجدار البطيني البطيني. يتكون الجدار البطيني الحويصلي من طبقة الخلايا الأورسية(الشكل 1A). الأهم من ذلك، تجسد ependymoglia حمار وحشي خصائص كل من الثدييات الغليا شعاعي والخلايا ependymal. العمليات شعاعي طويلة هي سمة نموذجية من خلايا غليا شعاعي، في حين أن ملحقات الخلوية وتقاطعات ضيقة (فضلا عن مواقفها البطينية) هي ملامح نموذجية من الخلايا ependymal12،13،14. لذلك، يشار إلى هذه الخلايا باسم الخلايا الإيبنموجلية.
لمتابعة في سلوك الجسم الحي من الخلايا ependymoglial واحدة أثناء التجدد، فإنها تحتاج إلى أن تكون وصفت بشكل موثوق. وقد سبق وصف أساليب مختلفة من وضع العلامات في الخلايا الحية للميكروسكوب الفلورسنت، مثل الصحفيين الذاتية أو الأصباغ lipophilic15. وقد تتطلب هذه الأساليب، على النقيض من الكهرباء، فترات زمنية أطول، وكثيراً ما لا تتيح إمكانية وضع علامات على خلية واحدة أو تتبع دائم طويل الأجل. الكهربة، ومع ذلك (إلى جانب وضع العلامات خلية واحدة)، ويوفر إمكانية إدخال الحمض النووي الجديد في الخلية المضيفة. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع غيرها من أساليب نقل الحمض النووي في الخلايا، وقد ثبت الكهربائي لتكون واحدة من أكثر الطرق كفاءة16،17،18،19.
يعرض هنا بروتوكول الكهربائي الذي تم صقله لغرض وضع العلامات على الخلايا ependymoglial واحدة في telencephalon حمار وحشي الكبار. يسمح هذا البروتوكول بوضع العلامات على الخلايا الأيبنموغلية واحدة من أجل متابعتها على مدى فترة طويلة الأجل20 أو للتعامل مع مسارات محددة بطريقة الخلية المستقلة21،22.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول الكهربائي هو موثوق بها في طريقة الجسم الحي من وضع العلامات على الخلايا الأيبنموجلية الفردية. قد يحتاج البروتوكول إلى مزيد من التكيف لتسمية أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا العصبية أو oligodendrocytes. ولتحقيق وضع العلامات الناجحة، يمكن استخدام البلازميدات التي تحتوي على مروّجين …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
شكر خاص لجيمس قبطي لتحرير المخطوطة. كما نعرب عن امتناننا للتمويل المقدم إلى JN من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) من قبل SFB 870 وSPP “التحليل التكاملي للOlfaction” و SPP 1738 “الأدوار الناشئة من RNAs غير الترميز في تطوير الجهاز العصبي واللدونة والمرض”، SPP1757 ” عدم تجانس جليال”، واستراتيجية التميز في إطار مجموعة ميونيخ لأنظمة علم الأعصاب (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN – 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
- Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
- Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
- Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
- Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
- Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
- Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
- Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish – from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
- Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
- Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).
- Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
- Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
- Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
- Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
- Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
- Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).
- Barbosa, J. S. . In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).
- Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
- Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. . Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).
- Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).
